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细胞活性的检测方法比较 简介：细胞活性是进行细胞生物学实验的一项重要指标，是评价细胞培养、细胞毒性及生理 研究的基础。一些基于细胞的下游分析实验，需要前期有好的细胞，才能保证下游的实验结 果的可信度以及实验的可重复性，因此，细胞活性的实验具有广泛的应用。目前关于细胞活 性的检测方法多种多样，如基于台盼蓝染色的细胞计数，以及在此基础上的图像分析型的计 数设备，或者是基于荧光染料标记的流式细胞术的分析等。本文将一种新的检测方法与传统 的检测方法进行比较，考察不同方法之间数据的差异性与方法学本身的操作性和成本进行比 较。 细胞活性的定义具有多样性，通过对关键的细胞生理指标进行标记来进行检测，如细 胞代谢的活性（酯酶的功能，MTT 法）、凋亡标记物（Annexin V ）、细胞氧化还原电位、膜 电位、增值率 （DNA 含量）、线粒体功能和膜的完整性等。虽然有如此多的指标参数，但是 基于对细胞膜的完整性和相关的染料排斥发检测，已经被广泛的认为是作为细胞活性检测的 标准。应用最广泛的细胞膜完整性的检测方法是台盼蓝染色法，该法最早是基于显微镜下观 测并且手工计数，过程费事费力，并且计数的系统误差较大。为了排除人工计数的误差，增 加计数过程的准确性，出现了基于仪器放大、拍照计数的方法。这样提高了计数过程的自动 化程度，但是依旧无法摆脱由于计数时焦平面的选择、颗粒识别的准确性问题，并且容易高 估细胞活性。为了解决这些问题，一些荧光染料被发明进行使用。该法能够较台盼蓝染色提 高100 倍或者更高的检测准确性与灵敏度。这类型的荧光染料中，碘化丙啶（Propidium Iodidi ， PI）是应用最广泛的一种标准染料。 与其他基于荧光染料标记的实验一样，该法的缺点就是需要使用荧光显微镜或者是流 式细胞仪。前者要求配置一套荧光显微镜，相对应的激发光源以及滤光片，并且操作过程依 旧是手工操作，人工计算实验结果，过程耗时还无法避免人为的主观因素。而流式细胞仪能 够准确的计数，并且进行统计学分析，但是设备昂贵，需要有经验的实验人员进行专门操作， 以及需要一定的设备维护等问题。 Orflo 公司创新性的研发出了第一台便携的流式检测系统，能够提供高精度的PI 活性 检测的实验数据，仪器无需预热，无需清洁与维护，检测快速，不需要专门的仪器操作人员 和相关背景知识的人员。Moxi Flow 是世界上第一台结合库尔特原理（精确颗粒计数和粒径 分析）和单荧光通道 （PMT ）检测的便携流式。本文中将对几种不同的细胞活性检测方法 进行比较。 图1-Orflo Moxi Flow 系统及芯片，Moxi Flow 是世界上第一台便携流式细胞计数仪，它结合 了基于阻抗法和荧光通道的检测，预设了常用的检测程序，无需设置复杂参数，无需进行复 杂操作，芯片即插即用方便快捷。 更多介绍请见：/newsf/2013-9/2013924135207743.htm 实验方法 细胞杀伤处理 分别用加热（60℃，30min）、500mM 过氧化氢 （H2O2 ，Sigma）、饥饿处理 （1 周）的 方法处理细胞，每组实验根据比例分别用空白对照的细胞配置成不同标准活细胞比例浓度组。 活性检测 将经过杀伤处理的细胞与未处理的空白对照细胞进行一定比例的混合，配置成活细胞比 例分别为 100%、85%、70%、55%、40%、25%、10%和0 的标准品，分别用Moxi Flow （Orflo Technologies）、Guava PCA 流式细胞仪 （Merck Millipore）、基于台盼蓝染色的成像计数仪 （TC-10 ，BioRad）和血球计数板（n=3）。后续数据使用软件IGOR Pro （Wavemetrics）进 行分析作图。 Moxi Flow 计数和活性检测 细胞样本用5μg/ml 的PI 染色（Life Technologies ），孵育5min ，所有染色后的样本在 20min 内完成检测，所有分析操作均在Moxi Flow 仪器上进行。 Guava PCA 计数和活性分析 待测的细胞样品50μL 与450μL 的Viacount 试剂（Merck Millipore）混合，孵育5min ，所有 染色后的样本在20min 内完成检测，数据使用FlowJo 软件包（Treestar）进行处理分析。 成像系统与血球计数板计数和活性检测 0.4%的台盼蓝溶液（Life Technologies ）按照1 ：1 的体积比例与细胞悬液混