肝组织石蜡切片8-OHdG免疫组化方法的研究.pdfVIP

广 医 科 大 学 报 JOURNAIOFGUANGXIMEDICAIUNIVERSITY 2011Jun；28(3) I RSI 肝组织石蜡切片 8一OHdG免疫组化方法的研究 窦东伟 李裕波 苏 卡 李佳荃 彭 涛 刘志明△ (广西医科大学第一附属医院 胃肠腺体外科 南 宁 530021) 摘要 目的：探讨肝组织石蜡切片8OHdG免疫组织化学 (免疫组化)染色的实验方法。方法：以皮肤组织作为阳性对照，PBS 代替一抗作为阴性对照，采用 4种不 同实验条件在肝组织石蜡切片中行 8-OHdG免疫组化方法染色。结果：实验条件 3，即高 温高压柠檬酸盐(pH6．0)缓冲液+胃蛋 白酶 K(10rag／L)的联合修复方法，并采用 1 TritonX一100打孔过夜的方法能在肝组 织 中做出可靠阳性结果 。结论 ：实验条件 3为 80HdG免疫组化染色取得可靠阳性结果的最合理的方法。 关键词 8一()HdG；肝组织 ；免疫组化方法 中图分类号 ：R-331 文献标志码 ：A 文章编号：1005930X(2Ol1)03—035203 肝细胞癌 (HepatocelIu1arcarcinoma，HCC)是我 国常见 试剂盒 (20X)购 自福建迈新生物技术开发有 限公司。 的高致死性肿瘤。各种损伤 引起的DNA突变与肿瘤 的关系 1．3 实验方法 ：常规烤片，脱蜡至水 。 是研究的热点 。在 HCC发病机制 中，各种 因素产生氧化应 条件 1：①高压热修复：将玻片置于 0．01mol／L枸橼酸 激 (oxidativestress)造成 的氧化性 DNA损伤起着重要作 钠缓冲溶液 (pH6．O)中，高压修复 10min后 ，自然冷却至室 用 。8一羟基脱氧鸟苷酸 (8-Hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG) 温。②PBS冲洗 ，5min×3次。③3 H20室温孵育5～10min， 是 DNA氧化性损伤 的直接产物 ，肝组织石蜡切片 8-OHdG 以消除内源性过氧化物酶 的活性 。④PBS冲洗 ，5min×3 免疫组织化学 (免疫组化)染色是证 明肝组织 DNA损伤的直 次 。⑤5 ～1O 正常兔血清 (一抗为山羊来源，下 同)封 闭． 接证据 ]，可以作为研究 HCC发病机制的重要手段。因此 ， 室温孵育 10min。倾去血清 ，勿洗 ，滴加 1：200比例稀释的 肝组织中8OHdG的免疫组化检测具有重要意义。但免疫 一 抗 (1 TritonX 100稀释)，4℃过夜 。 组化技术主要用于各种蛋 白质或肽类物质表达水平和耐药 条件 2：①10mg／I蛋白酶 K，37℃孵育40min。②PBS 基 因蛋 白表达的检测 ，对于核酸来源的 8OHdG的免疫组化 冲洗 ，5minxi3次 。③3 H。O 窀温孵育 5～10min，以消除 检测存在一定难度 。以往文献报道 8OHdG 的免疫组化方 内源性过氧化物酶 的活性 。④PBS冲洗 ，5minxi3次 。⑤ 法有许多种口 ，主要区别在于抗原修复方式的不同，以及通 5 ～10 正常兔血清封闭，室温孵育 10min。倾去血清 ，勿 透剂 TritonX100(聚乙二 醇辛基苯基醚)的利用 。本实验 以 洗 ，滴加 1：200比例稀释的一抗 (1 TritonX—100稀释)， 皮肤组织作为阳性对照 ，采用不同实验条件链霉卵白素～过 4℃过夜 。 氧化物酶连接法(SP法)检测肝组织石蜡切片中8-OHdG的 条什 ：①高压热修复 ：将玻片置于 0．Olmol／I枸橼酸 表达情况 。 钠缓冲溶液 (pH6．O)中，高压修复 10min后 ，自然冷却至室