苏云金芽胞杆菌质粒p26复制功能区的克隆.pdfVIP

第3O卷 第 5期 华 中 农 业 大 学 学 报 Vo1．3O No．5 2011年 1O月 JournalofHuazhongAgriculturalUniversity Oct．2011，558～562 苏云金芽胞杆菌质粒 p26复制功能区的克隆 季思思 朱义广 彭东海 阮丽芳 孙 明 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070 摘要 利用特异引物从基因组 BAC文库筛选到 1个 35kb的片段，对该片段测序比对分析发现可能含有 p26的复制区。为了验证该片段中是否含有 p26的复制 区，首先，将大肠杆菌和苏云金芽胞杆菌穿梭载体 pHT304用 EcoRI酶切切掉苏云金芽胞杆菌复制子后 自连，获得复制子克隆载体 pHT304E~随后，将 12kb EcoRI片段亚克隆到载体pHT304E上电转化无晶体突变株BMB171，获得具有抗性的转化子，证明该片段具有 复制功能。缺失实验证明最小复制功能区包含2个必需的ORF。经过 4O代无抗培养，最小复制区复制稳定性 达到9O 以上 。 关键词 苏云金芽胞杆菌；质粒；特异引物；细菌人工染色体文库；克隆；复制子；缺失突变 中图分类号 Q754 文献标识码 A 文章编号 1000—2421(2011)05—0558—05 苏云金芽胞杆菌 (Bacillusthuringiensis)中包 白是一类 FtsZ／tubulinGTP聚合酶超家族的马达 含着极其丰富的质粒资源，而且这些内生质粒的拷 蛋 白，可以在细胞 内自聚合形成多聚体[7；orf157 贝数、复制方式及稳定性等也不相同。质粒的克隆 编码的蛋白含有 HTH保守结构域并可以和复制起 为研究苏云金芽胞杆菌质粒的特性、功能及进化关 始区域 (ORI)特异性结合，证明这是一个新型的质 系等方面的基础理论研究提供了丰富的遗传信息， 粒复制分离机制[8]。 也为在质粒克隆的基础上构建出有效的遗传工程载 苏云金芽胞杆菌YBT-020属于幕虫亚种 (sp． 体及构建高效广谱的工程菌提供了可能。 finitimus)，具有晶胞粘连现象。在之前的研究_9]中 环状质粒的复制可以被分为滚环复制(RC)和0 发现，cry26Aa定位在 1个大约200kb(p26)的质粒 复制 2大类 。RC质粒分类是依据双链复制起点和 上，而该质粒的复制模式还未知。本研究克隆得到 和复制起始蛋 白的同源性来分类的[1]。0复制是根 苏云金芽胞杆菌幕虫亚种大质粒的最小功能域，确 据它们的组织结构和在复制过程对宿主复制蛋白的 定其最小复制区，并分析该复制区的稳定性 。 需要来进行分类的_2]。在苏云金芽胞杆菌中相继有 1 材料与方法 一 些 0复制的复制子被克隆和鉴定，例如，从苏云金 芽胞杆菌库斯塔克亚种 HD263的3个质粒 p43、 1．1 菌株、质粒和引物 p44和p60分别克隆到各 自的复制子_l3]，从苏云金 本研究用到的菌株和质粒见表 1。 芽胞杆菌库斯塔克亚种HD73分离到跟结合转移相 1．2 培养基、抗生素、工具酶及主要试剂 关的广宿主质粒 pAW63，并且对该质粒 4．1kb的 LB培养基，用于常规培养。 复制子进行了分析验证[4]。 TSB培养基：胰蛋 白胨 1．596／，大豆蛋 白胨 pBMB165是 苏 云金 芽胞杆 菌拟 步 行亚 种 0．59／6，氯化钠 0．5 ，pH7．2。 YBT-1765中检测到的最大质粒，它的复制和稳定 选择性培养基中，除特殊指明外，各种抗生素的 性相关基因都被确定[5]。最近，在苏云金芽胞杆菌 使用终质量浓度为：氨苄青霉素 (ampicillin，Amp) 以色列亚种克隆到一种新型的复制子[6]，由2个基 100 ¨g／mL，红 霉 素 (erythromycin，Erm)25 因orf156和 orfl57组成，其中，orf156编码的蛋 gg／mL；卡那霉素(kanamycin，Kan)25¨g／mL。