麻栎ISSR-PCR扩增条件的优化.pdfVIP

一 3D一 江苏农业科学 2011年第 39卷第 4期 彭礼琼，金则新，祁彩虹，等．麻栎 ISSR—PCR扩增条件 的优化[J]．江苏农业科学，2011，39(4)：30—32 麻栎 ISSR PCR扩增条件的优化 彭礼琼 ，金则新 ，祁彩虹。，李钧敏。，王 强。， (1．北京林业大学 自然保护区学院，北京 100083；2．台州学院生态研究所，浙江临海 317000； 3．西南大学三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆 400715；4．上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234) 摘要：采用改进的SDS法提取麻栎基因组 DNA，利用单因素试验对 ISSR反应体系中的Mg“浓度、dNTP浓度、模 板DNA用量、TaqDNA聚合酶用量、BSA浓度、引物用量进行筛选和优化，得出了适用于麻栎 ISSR分析的扩增条件： 10txLPCR反应体积，1×Taq酶配套缓冲液 (200mmol／LTris·HC1，pH值8．8，100mmol／LKC1，1％TritonX一100， 100mmol／L(NH4)2SO4，15mmol／LMgC12)，0．75UTaqDNA聚合酶，10ng模板 DNA，10pmol引物，0．4mmol／L dNTP，3．5mmol／LMg2。利用优化反应体系从 100个ISSR引物中筛选出12个重复性好 、稳定性高的引物对21个麻 栎个体的DNA进行扩增，共得到85个位点，其中61个为多态位点，多态位点百分率为71．76％，Nei指数为0．3222， Shannon信息指数为0．4593，表明麻栎的遗传多样性处于较高水平。 关键词：麻栎；ISSR；优化 ；遗传多样性 中图分类号：$792．181 文献标志码：A 文章编号：1002—1302(2011)04—0030—03 简单重复序列区间(inter—simplesequencerepeat，ISSR) 低温冰箱保存，供 DNA提取。 是 Zietkiewiez等 创建 的建立在 PCR基础上 的一种新 的分 1．2 方 法 子技术，它结合了SSR和 RAPD的优点，并 由于其具有引物 1．2．1 DNA提取与定量 采用改 良的SOS法提取 DNA 。 开发费用低、DNA用量少、多态水平高等特点 ，近年来已广 DNA经0．8％琼脂糖凝胶电泳分析，用GIS凝胶成像分析系 泛用于品种鉴定、物种多样性等相关领域的研究 。由于 统 (上海 天能科技服务公 司)拍照定量，稀释成终浓度 ISSR技术也是基于PCR的一种分子技术，因此，影响PCR效 20rig／p,L，一2O℃保存，备用。 果的因素诸如牛血清 白蛋 白浓度、Mg 浓度、dNTP浓度、模 1．2．2 ISSR原初扩增条件及 PCR扩增程序 ISSR引物采 板DNA用量、引物用量以及 TaqDNA聚合酶用量等均会影 用加拿大哥伦 比亚大学提供的序列 (UniversityofBritishCo— 响ISSR的扩增结果。因此，为了获得稳定而可靠的扩增结 lumbia，SetNo．9，NO．801～900)，由上海生工生物工程公司合 果，在研究时都应先建立合适的反应体系并对其进行优化。 成。原初 ISSR扩增反应体系为：10 的PCR反应体积， 麻栎 (Q rc acutissima)属壳斗科栎属的落叶乔木，在 0．3mmol／LdNTP，1mr,／mL牛血清 白蛋 白，20ng模板DNA， 我国分布广泛，常见于次生林中，也在成片人工林和松栎混交 6pmol：~l物 (上海 Sangon公司)，1UTaqDNA聚合酶 (北京鼎 林或散生分布，是传统的优 良能源树种。其木材硬度大、有弹 国公司)。ISSR—PCR扩增采用TouchdownPCR扩增程序： 性、耐腐蚀，为优等家具、乐器等用材。其树皮、壳斗及果实均 94℃预变性5min；94℃变性 1min，57℃退火 1mln(每个循 可药用，具有收敛止血、涩肠固脱等功效，其树叶具有抗突变