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维普资讯 第 32卷 分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究报告 第 12期 2004年 I2月 ChineseJournalofAnalyticalChemistry 1575—1579 毛细管电动色谱分离手性氨基酸及其在生物样 品分析中的应用 付煜荣 颜流水 罗国安 陈翠真。 王义明 张兰桐 (清华大学分析 中心，北京 100084) (河北北方学院化学教研室 ，张家 口075000) (北京市眼科研究所 ，北京 100005) (河北医科大学药学院，石家庄 050017) 摘 要 建立 了MEKC法分离丙氨酸 (Ala)、谷氨酸 (Glu)和天 门冬氨酸 (Asp)三对手性氨基酸 ，并对大 鼠正 常组和白内障组晶体和血清 中D- a、-a、D-Glu、L-Glu、D-Asp和 L-Asp进行定量分析。利用 F1TC柱前衍 生，以JB一环糊精(JB—CD)作为手性添加剂 ，激光诱导荧光检测 (LIF)，优化电泳条件为：气压进样 5S，分离温度 25℃，分离电压为 20kV，运行缓冲溶液为40mmol／L硼砂缓冲溶液(pH9．3)，其中包含50mmol／LSDS和 l3 mmol／L3／-CD。考察 了硼砂缓冲溶液浓度、pH值、分离 电压、B|一环糊精浓度对分离的影响。在优化 电泳条件 下，上述 3种氨基酸对映体均得到基线分离，并可对大 鼠的晶体和血清进行定量分析。本方法操作简单，检测 灵敏度高，可用于药品质量监测 以及生物样品的分析。 关键词 毛细管电动色谱 ，激光诱导荧光，氨基酸对映体 ，口一环糊精 ，大 鼠 1 引 言 对映体异构体的分离要求分离技术具有高灵敏度、高选择性和高分辨率。毛细管 电动色谱 (MEKC)是手性拆分常用的分离模式之一 ，只需在背景电解质 中添加手性选择剂 ，构建手性环境 ，即可 进行手性拆分 。环糊精及其衍生物 (CDs)是应用最广泛的手性选择剂 ¨。。人体中存在 D一氨基酸 ，其 含量一般较 L型低 ，随着检测技术的不断发展 ，检测极微量 D一氨基酸成为可能。文献[3]以气相色谱法 研究了Asp消旋化的增长率与年龄的相关性。Fisher等 报道了老年前期痴呆患者脑室和腰椎脑脊液 中存在游离的D一氨基酸。某些D一氨基酸与疾病的相关性正引起人们的重视。 本实验所研究 的丙氨酸、谷氨酸和天门冬氨酸是与生命科学密切相关 的手性氨基酸。丙氨酸 (Ala)、谷氨酸 (Glu)和天门冬氨酸 (Asp)是分子量较小且均不含苯环的氨基酸，因而手性拆分难度较 大。本实验利用荧光素异硫氰酸酯 (FITC)进行柱前衍生化的方法 ，采用MEKC分离模式，以十二烷基 硫酸钠 (SDS)为准 固定相，以 一环糊精 (一CD)作为手性选择添加剂 ，拆分 D、L—Ala、D、LGlu和 D、L—Asp，并以高灵敏度的激光诱导荧光(LIF)检测器进行检测。本方法也可用于正常组和白内障组大 鼠晶体、血清中3种氨基酸D、￡含量的分析，为l临床检验和深入研究发病机理提供重要的理论依据。 2 实验部分 2．1 仪器和试剂 P／ACE5500型毛细管电泳仪及激光诱导荧光检测器 (美 国Beckman公司)，A 488nm，A 520 rim；未涂渍石英毛细管柱 ，37cmX50 mi．d．，(河北永年光纤厂)；pH计 (Beckman公司)；CX．100型超 声波清洗机 (北京市医疗设备二厂)；高速离心机 (上海安亭科学仪器厂)，1．6X10 r／min。硼砂 (NaBO ‘10HO，分析纯，北京红星化工厂)。十二烷基硫酸钠 (SDS，USA，电泳级)；氢氧化钠，分析 纯 (北京化工厂)；荧光素异硫氰酸酯 (FITC，Mr=384．1)、．CD(美 国Sigma公司)，含量大于 99％； D—Asp、D—Glu和D—Ala为美国Fluka公司产品，纯度大于99．8％。L—Asp、L—Glu和 L—Ala(上海第二军医 大学化学试剂研究室)，生化试剂。实验用水为二次去离子水 。 正常组和 白内障组 Wistar大 鼠晶体、血清 由北京眼科研究所陈翠真研究员提供，于 一20℃下冰冻 保存。鼠龄为30天龄 ，白内障模型用链脲佐菌素诱导 j。