树突状细胞瘤苗的制备及体外抗肿瘤实验研究.pdfVIP

维普资讯 沈阳部队医药 · 415 · 树突状细胞瘤苗的制备及体外抗肿瘤实验研究 徐 富’ 靳建亚’ 茆有怀’ 张培毅’ 摘要 为探讨特异的树突状细胞(Dc)肿瘤疫苗的制备方法及体外抗肿瘤作用，分离人周围血单核细胞， 制备Dc，体外应用Hela细胞提取物作为抗原(包括可溶性抗原和颗粒性抗原)，结合Dc制备特异性的肿瘤疫 苗；再与淋巴细胞混合培养，用激活的淋巴细胞按不同比例与Hela细胞混合培养，应用MTT法观察淋巴细胞对 肿瘤细胞的杀伤率。结果：经特异的肿瘤抗原刺激后的Dc疫苗可活化淋巴细胞，与对照组比较可明显提高其 对肿瘤细胞的杀伤活性。结论：Dc特异肿瘤疫苗具有高效、特异的刺激淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的能力。 关键词 树突状细胞 疫苗 实验研究 树突状细胞 (dendriticcell。DC)作为抗原递 板中，分别加人可溶性抗原和颗粒性抗原刺激的 呈细胞，在肿瘤免疫中发挥重要作用。本实验探 DC，以不加DC组作对照。另外。各孔均加人白细 讨了应用人周围单核细胞体外培养制备特异性 胞介素2400U，培养5天。收集淋巴细胞制成细 DC瘤苗的方法及体外抗肿瘤作用。 胞数1X10。／ml，可溶性抗原组效／靶比按50：1、 25：1、12．5：1混合培养。颗粒性抗原组及无 1 材料和方法 DC对照组效靶比按50：1，每组设3个复孔。培 1．1材料 rhGM—CSF(北京医科大学免疫室)； 养20h后，加人MTT20 l(5mg／m1)。培养4h， rhIL_4和TNF．(PeproTechECLtd)；MTT即噻唑 吸去上清加人150 lDMSO，静置20rain，振荡 10 蓝(Sigma公司)；RPMI1640(GIBCO公司)；淋巴 min。用酶联免疫检测仪于570nm处，测A值并 细胞分离液(Pharmacia)；胎年血清(杭州四季青 记录结果。结果用3孔均值表示。杀伤活性按如 生物工程材料研究所)；LC400型酶联免疫检测仪 下公式计算：杀伤率 ：[1一(实验组A组 一效应 (法国产)；Hela细胞系(本院儿科实验室赠)。 细胞组A值)／靶细胞A值]x100％。 1．2方法 1．3统计学处理 数据用均数 ±标准差(±s)表 1．2．1Hela细胞抗原的制备 取正常培养的He． 示，采用studentt检验。统计用EXCEL软件。 1a细胞稀释至 1×10。／ml，液氮中反复冻融3次， 2 结 果 再行超声粉碎30min，离心，分别留取上清液及细 胞碎片(即颗粒性抗原)，一20cc保存备用。 2．1DC生长观察 分离周围血单个核细胞，培养 1．2．2特异DC的制备 采用朱学军等 报道的 3天开始分裂增殖，开始出现少量体积大的细胞， 方法加以改进。常规分离健康志愿者周围血单核 细胞膜不规则，其数量随着培养时间延长而增多。 细胞，用含 10％胎牛血清的RPMI1460培养液调 体积逐渐增大，并开始脱壁生长，逐渐形成大量细 至细胞浓度为 1X10。／ml，加入 24孔板，每孔 1 胞集落。胞核呈不规则形态，表面有突起，细胞体 ml，5％CO：、37cc孵箱培养3h，吸弃上清及悬浮 积可达淋巴细胞的数倍，大部分脱壁。细胞杀伤 细胞，将贴壁的单核细胞加入细胞培养液，同时加 实验时镜下还可观察到数个淋巴细胞围绕一个肿 入rhlL-4和rhGM-CSF，使其终浓度分别为400 瘤细胞 ，而部分肿瘤细胞可见溶解坏死。 U／ml和 100ng／ml；3天时半量换液，同时补充上 2．2细胞杀伤实验结果 见附表。 述细胞因子，并加入肿瘤细胞可溶性抗原及细胞 结果提示特异性DC瘤苗刺激的淋巴细胞杀 碎片抗