激光显微切割技术在甲基化水平检测中的应用.pdfVIP

·- -— — 1396 ——-—— ChinJLabDiagn，August，201l，V0】15。No．8 文章编号：10cr7—4287(2011)08—1396—02 激光显微切割技术在 甲基化水平检测 中的应用 杨 明 ，王丽萍 ，茅淑砚 ，吕静静 ，蒲春雪 ，王悦增 (1．吉林大学第一医院乳腺外科，吉林 长春 13(1021；2．吉林大学中日联谊医院病理科； 3．吉林大学病理生物学教育部重点实验室) 睾丸特异性蛋白质 50I5150是利用甲基化敏感差分析 1．4 重亚硫酸盐处理基因组DNA后，PCR扩增启动子的cPg 技术(M Ⅺ)A技术)从睾丸和乳腺癌组织中分离出来的低甲 岛区域。PCR扩增引物为：5-GGG1TrAAGGAGGGAAGrI1A’GT． 基化片段。其表达的51P50蛋 白质与丝氨酸蛋白酶具有同 3 和5-ACCI℃TAATAAACTAAATAAAAATACI℃C一3。 原性。通过免疫组织化学技术证明了TSPS0的产物特异性 1．5 将PeR产物电泳、提纯回收 目的片段 连接于pGEM． 表达在乳腺癌中，而正常乳腺组织中则不表达。本文利用激 TEasy载体上 (Promega公司)，转导到感受态 DH5a大肠杆菌 光显微切割技术及重亚硫酸盐基因组 DNA序列法检测正常 细胞中，筛选阳性细菌菌落进行扩增，随机提取 10-20个质粒 乳腺组织和乳腺癌组织中TSP50启动子区域 甲基化位点的 纯化并送样品测序 (Genewiz公司)。 甲基化状态，阐述TSPS0乳腺癌组织中表达的机制。 2 结果 1 材料与方法 2．1 TSPS0基因启动子 TSPS0基因启动子包含 CpG岛和 1．1 正常乳腺组织和乳腺癌组织 取材于吉林大学第一医 转录活性区，启动子的活性我们先前曾经鉴定过uJ。人DNA 院和白求恩医学院病理学系活体组织检查，并经过病理学诊 经重亚硫酸盐处理后 PCR扩增的片段为一89到一257，长度 断确诊。正常人睾丸组织取材于吉林大学 白求恩医学院病 为 168bp，这个 cpG岛包括 12个cG和TATA盒子(图1)。 理学系尸体解剖，按常规方法分别提取组织DNA基因组。 2．2 测序结果 1．2 激光显微切割 取新鲜乳腺癌组织，10 厚冰冻切 图2为质粒测序结果。测序结果分析，我们发现扩增片 片，苏木精复染细胞核。显微镜下标记乳腺癌癌巢 ，应用激 段的DNA序列中的CG以外的所有C均被扩增成为T，说明用 光将标记癌巢切割下来 ，收集乳腺癌肿瘤细胞，按常规方法 重亚硫酸盐处理基因组 DNA结果完全正确。应用NIBC网站 提取DNA基因组。 两组基因序列比对的软件，将测序的扩增片段与正常基因组 1．3 重亚硫酸盐处理基 因组 DNA 使用chemicon公司 DNA序列比对，结果见图表。TSPS0启动子CpG位点甲基化水 CpGenomeTMDNAModification试剂盒，按照要求处理基 因组 平在正常人睾丸组织为 10％～3o％，正常乳腺组织为79％一 DNA，并回收DNA基因组片段。 100％，乳腺癌组织为 ％一4o％，乳腺癌细胞为0％一30％。 ．3ll l2 ll l豢 l3 9 S - 24 ec 0cc￡量!}(；(j。}( 茂目∞A10o ‘僦 Ac d)c CC碱 粼 A 4