甜菜硝酸还原酶基因编码氨基酸偏好及功能预测分析.pdfVIP

2011正 中 国 糖 料 第 4期 SugarCropsofChina 3 文章编号 ：1007—2624(2011)04—0006—04 甜菜硝酸还原酶基因编码氨基酸偏好 及功能预测分析 丁广洲，，侯 静，马凤鸣 (1_中国农业科学院甜菜研究所 ，哈尔滨 150080；2．黑龙江大学农作物研究院，哈尔滨 150080；3_东北农业大学农学院，哈尔滨 150030) 摘 要 ：利用同源序 列克隆方法从标准偏 高糖型甜菜二倍体纯系Ty7中获得氮素诱导甜菜硝酸还原酶基 因片段 ，通过 RACE技术克隆基 因全长序列 ；该基 因ORF长度 2718bp，编码 905个氨基酸 ，分子量大小为 102kD(ExPaSy的分子 量分析)，等 电点为6．12，含有 147bp的5UTR和382bp的YUTR，Genbank上的注册号为EU163265，甜菜硝酸还原 酶基因编码多肽舍有 3个氧化还原功能区：钼辅因子功能区(eukaryNRMoco；93．478)，Fe一血红素结合区(Cyt—b5； 535-608)．FAD 结合区(FADbinding6；653—760)。利用网上的公共数据库和相关软件对该基因氨基酸偏好和编码蛋 白的理化性质进行 了分析 ，并对其功能进行 了预测。上述研究结果为下一步基因的表达与调控研究奠定了基础。 关键词 ：甜菜；硝酸还原酶基因；氨基酸偏好 ；功能预测 中图分类号 ：$566．301 文献标识码 ：A 在高等植物氮代谢过程中，与NO还原有关的基因包括NR基因(ni。)和NiR基因(n )。高等植物的NR 由ni口编码。至今，ni口或n cDNA至少 已在下列植物中被克隆：菠菜 (ProsserLazarus，1990；Tamura等， 1997；Kubo等 ，1998)、笋瓜 (Crawford等 ，1986；Hyde等 ，1991)、烟草 (Cherel等 ，1990；Vaucheret等 ，1989； Yamamot0等，2006)、拟南芥 (Cheng等，1988；Crawford等 ，1988；WilkinsonCrawford，1991，1993)、水稻 (Choi等，1989；Matsumoto等，2005；Ohyanagi等，2006；hoh等，2007)、大豆 (Wu等，1995)、玉米 (Campbell 等，1995；Katagi等，1999)、番茄 (Daniel—Vedele等，1989；王利群，2003)、桃 (Nakamura等，2001)、菜豆 (Hoff 等 ，1991；Jensen等，1994，1996)、大麦 (Miyazaki等 ，1991，Schnorr等 ，1991)、马铃薯 (Harris等 ，1997； Yamamoto等，2003)、甘蓝型油菜 (rckuoka，1996)、蓖麻 (Tsai等，2003)、矮牵牛(SalamoubatBudang，1993) 等 目前．还没有其他的关于甜菜硝酸还原酶基因全序列被克隆注册的报道。 1 材料与方法 1．1 供试品种 实验采用黑龙江省甜菜 (Bet0 lgarisL．)主栽二倍体纯系品种甜研 7号(Tv7)，原种由中国农科院甜菜 研究所提供。种子在室温下浸种 7h．置于培养皿中25℃恒温培养24～48h萌发 ，定植至营养钵中，置于光照培 养箱 中培养，待植株长到 2～4对真叶时进行硝酸钾(30mmol／LKNO，)诱导处理，然后用于实验操作 。 1．2 采用 RACE技术克隆甜菜硝酸还原酶基因 取硝酸钾诱导后的甜菜叶片0．1g，使用 TriZOl试剂盒(Invitrogen，USA)提取总RNA，电泳检测其质量， 置一70℃保存 前期利用同源序列克隆技术筛选拼接得到一个 1438bpNR基因片段。采用 SMARTMTRACE cDNAAmpli6cationKit(C1ontech．USA)进行 5端和3端的RACE反应。根据中间片段设计基因特异性引物 (GSP)(表 1)。以5GSP与 UPM引物扩增基因的5 表 1 试验中采用的引