国境口岸汉坦病毒实时荧光RT-PCR检测方法 编制说明.docVIP

出入境检验检疫行业标准草案编制说明 编写模版（格式） 出入境检验检疫行业标准草案编制说明的编写模版 1 基本信息 1.1 标准草案名称 中文 国境口岸汉坦病毒实时荧光RT－PCR检测方法 英文 Detection of hantavirus by real-time fluorescence RT-PCR at frontier port 1.2 与国际标准和国外先进标准一致程度情况 等同 修改 非等效 标准号 英文名称 中文名称 1.3 任务来源 批准立项的文件名称和文件号 关于下达2011年出入境检验检疫行业标准制(修)订计划项目的通知（国认科函[2011]54号2011B308k 1.4 制（修）订情况 √制订 修订 替代的标准编号 1.5 起止时间 2011年4月～2013年12月 1.6 起草单位 福建国际旅行卫生保健中心 1.7 起草人 王宇平、张建明、高博、蔡亨忠、张建庆、黄恩炯、许卿 1.8 专业类别 卫生检疫 1.9 标准体系表代码 1.10 调整情况 2 背景情况 2.1 目的、意义 肾综合征出血热（HFRS）是由汉坦病毒（HV）引起的急性自然疫源性疾病，是我国重点防治的传染病之一。HV在全球分布广泛，型别众多，啮齿类动物是其主要宿主，每型病毒具有相对稳定的宿主，与啮齿类动物种类形成相对应关系。美国CDC重新制定的《预防突发性传染病：21世纪新对策》将肾综合征出血热列于其中，建立了长期监控系统。我国是肾综合征出血热重灾区，地理生态复杂，HV宿主动物种类繁多，年报道病例数占世界报道病例数约90%。我国国境口岸众多，人员往来频繁、贸易量大且情况复杂，HV宿主啮齿类动物在我国很多口岸均有截获报道，防止鼠传疾病入境传播在各口岸成为现实而严峻的问题。 目前HV的实验室诊断有免疫学和RT-PCR方法，前者主要包括血凝抑制试验、免疫荧光技术、蚀斑减少中和试验等，但HV型别较多，交叉反应及国内建立的单克隆抗体对国外流行病毒株反应数据不明，且有些方法较为复杂、操作流程长，需操作者丰富的经验，难以在口岸一线应用；后者也存在检出时限长，无法适应口岸卫生检疫时效性，同时需反复开盖检测容易造成污染的缺点。实时荧光PCR技术适合口岸卫检实验室病原体快速检测需求，操作简便、快速，敏感度高，重复性好，易于在口岸检疫工作中推广。制定汉坦病毒实时荧光RT-PCR检测方法标准，将有助于规范汉坦病毒实验室检测步骤，提高结果的可信度，并有利于实验室之间的结果比较，从而加强口岸对汉坦病毒的监测，保障国境口岸卫生安全。1. 引物探针的设计与合成 在查阅相关文献基础上，从NCBI下载汉坦病毒（汉滩型）和汉坦病毒（汉城型）有代表性S基因序列各15条，用DNAStar软件进行序列分析，找到共同保守区进行引物及探针设计。引物和探针由大连宝生物工程有限公司合成。扩增片段大小为250bp： HANT-F1：5’-GWGGVCARACAGCWGAYT-3’； HANT-R1：5’-TCCWGGTGTAADYTCHTCWGC-3’； HTN-P：5’-FAM-AGCATCATCGTCTATCTTACATCC-TAMRA-3’； SEO-P：5’-FAM-CCATAATTGTCTATCTGACATCA-TAMRA-3’。 2. 主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒，一步法荧光RT-PCR试剂盒。 荧光PCR仪。 3. 阳性对照的准备 由上海生工合成HTNV和SEOV基因片段，与pGEM-T Easy 载体分别构建克隆。PCR扩增T7启动子和插入序列，以此为模板，用MEGAscript T7 Kit进行体外转录，生成并纯化目的RNA，即为阳性对照RNA模板。 4. 扩增程序的确定 以TaKaRa One Step PrimeScript RT-PCR Kit为例，各种试剂的加样量分别为每个反应管中含2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ μL，Ex Taq HS μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ μL，40μM 上下游引物各μL，10μM探针μL，模板5μL，补水至μL。根据引物、探针、荧光PCR试剂盒的具体特性，确定退火和延伸温度：52℃退火30 sec，72℃延伸40 sec，在延伸阶段进行单点荧光检测。延伸时间可根据仪器进行适当调整，如ABI7500上可设置为34sec。 5. 灵敏度试验以×102～×106 copies/μL HTNV和SEOV RNA模板进行检测，×102仍有较明显的扩增曲线，说明本反应体系的检测灵敏度可达102 copies/μL。标准曲线如图1、2所示。 ，×102copy/μL～6×106 copy/μL） 6：6×105 copy/μL S