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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T XXXXX—XXXX 国境口岸西尼罗病毒实时荧光RT-PCR检测方法 Detection Method for West Nile Virus by real-time fluorescence RT-PCR at frontier ports （送审稿） - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准起草单位：。 本标准主要起草人：胡孔新杨鹏飞孙肖红杨宇国境口岸西尼罗病毒实时荧光RT-PCR检测方法 范围 本标准规定了国境口西尼罗病毒感染疑似病例或蚊携带西尼罗病毒核酸实时荧光RT-PCR检测方法，包括标本采集、保存及转运、样本处理、检测方法、结果判定及报告。 本标准适用于国境口西尼罗病毒感染疑似病例或蚊携带西尼罗病毒的实验室检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求WS 233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 中华人民共和国卫生部令第45号 西尼罗病毒 实验室生物安全要求 检测工作中的个人防护遵照GB 19489。应遵照GB 19489和WS 233对生物安全2级（BSL-2）实验室的生物安全要求。 使用过的实验用品应遵照GB 19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。 微型混合器、涡旋振荡器超低温冰箱(–0℃及以下)； 普通台式离心机； 高速冷冻离心机可调式微量加样器μL、100 μL、1000 μL）及配套带滤芯吸头； 荧光PCR检测仪LightCycler、ABI Prism 7500、ABI Prism 700型商品化系统如BD Universal Viral Culturette? Transport SystemAg-Path-IDTM one-step RT-PCR试剂盒。) 样本采集、保存与转运 样本采集 人血清样本：采集疑似病例的静脉血 3 mL～5 mL30 min使其凝固，然后 1500～2000 rpm 10 min，去除纤维蛋白和红血球，收集血清于2 mL 无菌螺口塑料管中。 蚊样本：根据实际工作需要采集蚊虫样本，按1～2 mL 螺口塑料管内。 样本的保存 采集疑似人感染感染-70 ℃以下冰箱。 蚊虫样本 在冰上操作。取出蚊样本，倒入研磨器中，加入1 mL 标本处理液，反复研磨至匀浆，置于4 ℃预冷的离心机上，12000 rpm 离心 10 min。取上清液进行核酸提取，剩余的蚊标本研磨液需保存在-70 ℃以下以备复查。 样本检测方法 样本的核酸提取 样本核酸提取采用QIAamp Viral RNA Kit 病毒 RNA 提取试剂盒进行)或其他等效核酸提取方法，实际操作时按试剂盒说明书进行。以下给出所提供试剂盒QIAamp Viral RNA Kit的具体操作步骤案例： 将采集的样本平衡至室温。 用移液器吸取310 μL无核酸酶的水加入到310 μg的Carrier RNA中，使Carrier RNA彻底溶解，得到终浓度为1 μg/μL的Carrier RNA水溶液。 根据样本的数量（n），先吸取裂解液（n×0.56） mL，再吸取Carrier RNA水溶液（n×5.6） μL 将两者进行充分混匀，每管分装0.56 mL。（注：剩余Carrier RNA水溶液应及时分装到无核酸酶的离心管中，-20 ℃保存，避免反复冻融）。 向每管Carrier RNA-裂解缓冲液中加入140 μL的血清标本或蚊标本研磨液,混匀后旋振荡15 s。 加入560 μL的无水乙醇，并涡旋振荡15 s。 吸取离心管中的630 μL 混合液（包括Carrier RNA裂解缓冲液、含血清标本或蚊标本研磨液及无水乙醇），转移到带有离心管的吸附柱内，以8000 rpm离心1 min。 弃掉废液，将吸附柱放回收集管，将剩余的630 μL混合液转移至带有离心管的吸附柱内，以8000 rpm 离心1 min。 弃掉废液，将吸附柱放回收集管并向吸附柱内加入缓冲液AW1（使用前检查是否已加入无水乙醇）500 μL，8000 rpm离心1 min。 弃掉废液，将吸附柱放回收集管并向吸附柱内加入漂洗液AW2（使用前检查是否已加入无水乙醇）500 μL，14000 rpm离心1 min。 弃掉废液，将吸附柱放回收集管，14000 rpm离心30 s，弃掉废液。 将吸附柱放置在一支无核酸酶的离心管上，并向离心柱内加入50 μL的无核酸酶的水，室温静置2 m