化学物质肝毒性生物标志物筛选方法 代谢组学方法.docVIP

目 次 前 言 III 1 范围 1 2 术语和定义 1 3 仪器和设备 1 3.1 气相色谱质谱联用(GC-MS)技术 1 3.2 液相色谱质谱联用(LC-MS)技术 1 3.3 核磁共振(NMR)技术 1 4 代谢组学方法 2 4.1 样品采集和制备 2 4.2 数据采集 2 4.3 数据分析 3 4.4 标志物识别与途径分析 3 5 报告 3 附录A（资料性附录） 4 参考文献 6 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准主要起草单位：中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：宋乃宁、陈会明、李蕾、李海山、艾文超、谢文平、王琤。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 化学物质毒性生物标志物筛选方法 代谢组学方法 1 范围 本部分规定了应用代谢组学方法进行化学物质毒性生物标志物筛选的方法。 本部分适用于应用代谢组学方法对化学物质进行毒性生物标志物的筛选。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本部分。 2.1 代谢组学 metabonomics/metabolomics 通过考察生物体系（细胞、组织或生物体）受到刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后），其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学)。 2.2 代谢组 metabolome 是基因组的下游产物也是最终产物，是一些残余生物体新陈代谢、维持生物体正常功能和生长发育的小分子化合物的集合，主要是相对分子量小于1000的内源性小分子)。 2.3 生物标志物 biomarker 在亚个体和个体水平上既可以测定污染物暴露水平，也可以测定污染物效应的生理和生化指标。 2.4 化学计量学 chemometrics 是一门化学分支学科，它应用数学和统计学方法（借助计算机技术），设计和选择最优的测量程序和实验方法，并且通过解释化学数据而获得最大限度的信息)。 3 仪器和设备 3.1 气相色谱质谱联用(GC-MS)技术 3.1.1 气相色谱仪 3.1.2 飞行时间质谱仪 3.2 液相色谱质谱联用(LC-MS)技术 3.2.1 高效液相色谱仪 3.2.2 超高效液相色谱仪 3.2.3 串联四级杆质谱仪 3.2.4 飞行时间质谱仪 3.3 核磁共振(NMR)技术 3.3.1 核磁共振波谱仪 4 代谢组学方法 代谢组学方法主要包括样品采集和制备、代谢组数据的采集、数据预处理、多变量数据分析、标志物识别和途径分析等步骤。代谢组学的研究对象为生物样本，包括体液(血液和尿液)、细胞液以及组织等，其中以体液为主。样品经预处理后，通过GC-MS、LC-MS、NMR等分离分析技术分析，得到代谢物指纹图谱，然后使用相关的数据处理软件进行分析，最后获得相应的生物标记物，或者获得某种特定生理状态下的特异代谢参数指标。 4.1 样品采集和制备 4.1.1 样品的采集 需要采集足够数量的代表性样本，减少生物样品中个体差异对分析结果的影响。 血清、血浆μl（不得低于200μl/例），避免反复冻融。血清样本不需要加肝素钠，直接装入微量离心管；血浆样本使用肝素钠抗凝，离心取上清液后在-80 ℃冷冻保存。 尿液样品的采集 每个样本采集量大约1ml，直接分装到离心管中，每管1ml，添加一滴（约10μl）质量体积为1/100（w/v）的叠氮化钠-80 ℃冷冻保存。 其他生物样品的采集 组织、器官样品需要进行研磨，细胞样品需要进行淬灭（反复冻融法、细胞超声破碎等）后在-80 ℃冷冻保存。 4.1.2 样品的制备 由于特定的提取条件往往仅适合某些类化合物，目前尚无一种能够适合所有代谢产物的提取方法。需要根据所选择的分析平台的要求进行处理。 基于NMR的代谢组学实验，典型的样品是经溶剂萃取或经提取的生物质液体。通常用于NMR分析的样品处理是个简单的过程，在含有样品的一定pH的缓冲溶液中，加入少量D2O或其他氘代试剂（氘代氯仿、乙腈或甲醇等）。 如采用质谱(MS)进行全成分分析时，样品处理方法相对简单，但不存在一种普适性的标准化方法，依据“相似相溶原则”，脱蛋白后代谢产物通常使用异丙醇、乙醇、酸化的甲醇、乙腈、水，以及甲醇和水的混合物来提取极性代谢物，使用氯仿和乙酸乙酯提取亲脂性较强的代谢物，从而把非极性相和极性相分开，以便进行分析。 就GC-MS分析技术而言，通常可将代谢物分为两大类：不需要化学衍生的挥发性代谢物和需要化学衍生的非挥发性代谢物。挥发性的代谢物不需要衍生化步骤即可从气相色谱流出。这类对象的采样方法主要包括直接收集和分析顶空样品、用固体吸附剂富集顶空货液体样品中的代谢产物、固相微萃取和溶剂萃取等。对极性强、挥发性低、热稳定性差的物质往往不能直接进样分析，