国境口岸西尼罗病毒实时荧光RT-PCR方法 编制说明.docVIP

出入境检验检疫行业标准草案编制说明 1.1 标准草案名称 中文 国境口岸西尼罗病毒实时荧光RT-PCR方法 英文 1.2 与国际标准和国外先进标准一致程度情况 □等同 □修改 □非等效 标准号 英文名称 中文名称 1.3 任务来源 批准立项的文件名称和文件号 计划编号 2011B306k 1.4 制（修）订情况 □制□修订 替代的标准编号 1.5 起止时间 年月--- 年月 1.6 项目承担单位 1.7 起草团队 胡孔新杨鹏飞孙肖红杨宇 1.8 专业类别 □食品（化妆品）检验；□卫生检疫；□动物检疫；□植物检疫； □纺织产品检验；□轻工产品检验；□机电产品检验；□化工、矿产品和金属材料检验；□管理；□鉴定；□包装及危险化学品 1.9 标准体系表代码 1.10 调整情况 国境口岸西尼罗病毒实时荧光RT-PCR方法国境口岸西尼罗病毒实时荧光RT-PCR方法 2 背景情况 2.1 目的、意义 RNA 病毒，属于黄病毒科黄热病毒属。该病毒最初在1937年乌干达西尼罗地区的发热妇女血液中分离出来。许多野生鸟类尤其是乌鸦是西尼罗病毒的天然储存宿主和传染源。西尼罗热的传播媒介包括了11个属80余种蚊类，但库蚊是主要的传播媒介。目前尚无特效药物治疗和疫苗预防预防西尼罗病毒感染最简单和最有效的办法我国大部分领土处在北纬23.50度，南纬66.50度的温带地区，而这一地区西尼罗病毒主要我国病毒宿主鸟种类繁多，并随季节南北迁移乙型脑炎病毒、登革热病毒与西尼罗病毒同为黄病毒属，有相近的生物学特性。而乙脑在我国多地区流行广泛，登革热也呈扩大流行趋势。 2.2 与国内外相关标准、文献的关系 快速检测方法 3 编制过程 3.1 准备阶段（可选项） 3.2 分工情况 3.3 标准草案编写情况 3.4 征求意见情况（适用于送审稿） 3.5 审定情况 （适用于报批稿） 3.6 预期的管理目标（适用于规程类标准）或技术指标（适用于方法类标准） 4 主要技术内容的确定 4.1引物、探针的设计与合成 参考文献（Lanciotti, R. S., A. J. Kerst, R. S. Nasci, M. S. Godsey, C. J. Mitchell, H. M.Savage, N. Komar, N. A. Panella, B. C. Allen, K. E. Volpe, B. S. Davis, andJ. T. Roehrig. 2000. Rapid detection of West Nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay. J. Clin. Microbiol. 38:4066–4071.）合成西尼罗病毒的引物探针序列。 4.2阴性对照克隆质粒、阳性对照克隆质粒的准备 由上海辉睿生物公司利用全基因合成技术合成WNV、DEN、SLE、HBV、YFV、JE等黄热病毒科的参照小片段DNA，分别与pGEM-T Easy 载体（美国Promega公司 4.3 方法优化 TaqMan RT-PCR 反应选用的试剂盒为Ag-Path-IDTM One step RT-PCR Kit（美国Ambion公司产品），扩增和检测在全自动荧光定量仪Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systems 上进行。 4.3.1 扩增程序的确定 根据引物、探针的具体特性，仪器上的反应程序在退火延伸条件选择上试验了3种温度和3种时间：95℃ 10分钟，95℃ 15秒→（58/60/62）℃（30/45/60）秒 ，在进行单点荧光检测2× RT-PCR Reaction Buffer 12.5 ul，WNV-FP(12.5μmol/L)1ul、WNV-RP(12.5μmol/L)1ul，WNV-P(12.5μmol/L)0.5ul, 25×RT-PCR Enzyme Mix 1μL，模板NA 5ul，用超纯水补足到反应总体积25μL。结果均可见阳性扩增曲线，但考虑到使引物扩增有更好的特异性和缩短反应时间，最后确定扩增程序为：95℃10分钟，95℃15秒→60℃45秒，40次循环。 4.3.2 最佳引物浓度的确定 2.4.1 的扩增程序，先固定探针终浓度为250nM，正、反向引物浓度在250nM、500nM、750nM、1000nM、1250nM 之间选择。按表2所列浓度加上、下游引物终浓度选择合适的引物浓