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实验十六 真核基因组DNA的分离纯化 核酸的分离与提取是分子生物学研究中最重要的基本技术之一，核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。 核酸分离提取的原则 核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA为单链环状分子；大多生物体内RNA分子均为单链线性分子并具有不同的结构特点，如真核生物mRNA分子多数在3端带有Poly A结构。 95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。RNA分子主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%在细胞核中，15%在细胞器中。 分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性（完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求）；②排除蛋白质、脂类、糖类等其它分子的污染（纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的污染应降低到最低程度；无其它核酸分子的污染，如提DNA分子时，应去除RNA分子。） 为保证分离核酸的完整性及纯度，应尽量简化操作步骤，缩短操作时间，以减少各种不利因素对核酸的破坏，在实验过程中，应注意以下条件及要求：①减少化学因素对核酸的降解：避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4~10条件下进行；②减少物理因素对核酸的降解：强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中，细胞裂解，反复冻贮等造成的机械剪切力以及高温煮沸等条件都能明显破坏大分子量的线性DNA分子，对于分子量小的环状质粒DNA及RNA分子，威胁相对小一些；③防止核酸的生物降解：细胞内、外各种核酸酶作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构；DNA酶需要Mg2+、Ca2+的激活，因此实验中常利用金属二价离子螯合剂EDTA，柠檬酸盐，可基本抑制DNA酶的活性，而RNA酶，不但分布广泛，极易污染，而且耐高温、耐酸碱，不易失活，所以生物降解是RNA提取过程的主要危害因素。进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。 核酸提取的主要步骤，无外乎破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子，沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质，最后得到纯化的核酸。 应用分子生物学技术分析基因组完整结构和功能，首先必须制备纯化的高分子量DNA，真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都可以用来制备DNA。 提取真核基因组DNA的方法由两部分组成：先温和裂解细胞及溶解DNA，使DAN与组蛋白分离，完整地以可溶形式独立分离出来，接着采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNA及其它分子。 真核细胞的破碎有各种手段，包括超声波、匀浆法、液氮破碎法、低渗法等物理方法及蛋白酶K和去污剂温和处理法，为获得大分子量的DNA，避免物理操作导致DNA链的断裂，一般多采用后者温和裂解细胞。 去除蛋白质常用酚、氯仿抽提，反复抽提操作对DNA链机械剪切机会较多，因此有人使用80%甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方法，可得200kb的DNA片段。 根据不同的实验要求，可选择不同的实验方法制备真核染色体DNA。 方案一 组织细胞DNA提取（酚抽提法） 【原 理】 将分散好的真核生物组织、细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质。破坏细胞膜、核膜，SDS可使组织蛋白与DNA分子分离，EDTA能抑制细胞中DNase的活性，使DNA分子完整地以可溶形式存在于溶液中，再用酚、氯仿/异戊醇抽提除去蛋白质，（氯仿可除去DNA溶液中微量酚的污染，异戊醇还可减少蛋白质变性操作过程中产生气泡）得到的DNA溶液经乙醇沉淀进一步纯化，为获得高纯度DNA，操作中常加入RNase除去RNA，此法可获得100~200kb的DNA片段，适用于构建真核基因组文库，Southern blot分析。 【试 剂】 1、组织细胞裂解液 100~200μg/ml 蛋白酶K 10mmol/L Tris－Cl（pH8.0） 0.1mol/L EDTA (pH8.0) 0.5% SDS 20 μg/ml RNase A 2、平衡酚（用0.5mmol/L Tris－Cl饱和，pH8.0）， 3、氯仿/异戊醇（24：1v/v） 4、3mol/L乙酸钠（NaAc，pH5.2） 5、冷无水乙醇（AR） 6、70%乙醇（-20℃静置） 7、TE缓冲液（10mmol/L Tris－Cl、1mol/L EDTA (pH8.0) 【操作步骤】 1、根据样品类型，采用以下方法之一作为步骤1：