黄瓜花叶病毒做为表达载体的可行性研究.pdfVIP

摘要 为了构建黄瓜花叶病毒 (CMV)表达载体，分离了山东株 ((SD)CMVRNA3 个长cDNA3卜测定了其全序列。采用定点突变的方法在衣壳蛋白 C〔P)基因的起始 密码子处引入 个Nsil位点，把SD-RNA3的cDNA构建成一个置换盒。将绿色荧 光蛋自(GFP)基因、p一葡糖醛酸酶 (GUS)基因和小鼠二氢叶酸还原酶 (DHFR) 基因三种报告基因分别插入Nsil位点和CP基因终止密码子上游的Xhol位点之间将 CP基因置换掉。把Fny株CMVRNA1和RNA2以及嵌合SD-CMVRNA3的cDNA 分别插入pCass载体的CaMV35S启动子和终止子之间，构建成侵染性cDNA克隆。 用相应限制酶酶切释放含35S启动子和终止子序列的嵌合SDRNA3.FnyRNA1和 RNA2的cDNA片段，混匀后以置换裂载体的形式直接转染烟草悬浮细胞系Y“-2 原生质体，三种报告基因均获得了表达子携带GFP基因的置换型载体接种到表达SD 醉 卜型载体。接种 10天后，18棵测试植株中， 有5棵的接种叶片上可观测到绿色荧光斑点。两个星期后，在 IOF株的系统叶中也 能检测到GFP。然而一个月后，所有接种植株上都检测不到GFP。从系统叶中提取 RNA，利用RT-PCR方法从4棵曾经检测到GFP的植株中扩增到重组形成的RNA3 的cDNA，表明在CMV载体与转基因之间发生了重组。同时在IOF株系统叶中还检 测到GFP基因及FnyRNA1和RNA2的正负链，表明转基因植株表达的CP可以反 式互补CMV病毒RNA (包括嵌合RNA3)，支持有限的系统移动。将来自IOF株 的RNA3的RT-PCR扩增产物克隆后，对11个含有CP基因的克隆进行序列分析， 推测5’的重组交换位点可能由CP基因起始密码子及其5’上游的12个碱基构成，而 3交换位点则可能位于嵌合RNA3和CP转基因的192个同源核昔酸序列内。这是 首次发现CMV基因组序列与转基因之间发生重组的报道。本研究对所构建的CMV 互补型载体的可行性提出了质疑，同时也启示了对改进CMV载体和转CMVCP基 因抗“植““的生安“全性的“的设”今 关键词:黄瓜花叶病毒，置换型载体，互补型载体，重组 StudiesontheFeasibiliytofCucumberMosaicVirusasanExpressionVector WanliLei(Genetics) DirectedbyProfessorRongxiangFang Inordertostudythefeasibilityofconstructingcucumbermosaicvirus(CMV)asan expressionvector,thefull-lengthcDNAofCMVSDstrain(SD-CMV)RNA3wascloned andsequenced.AnNsiIsitewascreatedatthesequencearoundthestartcodonofthecoat protein(CP)gene.CPgenewasreplacedbyreportergenesofgreenfluorescentprotein (GFP),p-glucuronidase(GUS)andmousedihydrofolatereductase(DHFR),respectively. 1and2andthechimericSDRNA3wereclonedbetweenthe ThecDNAsofFnyRNAs CaMV35SpromoterandterminatorinaderivativeofpCassvectorTobaccoBY-2 essedthethree protoplaststransfectedwiththecDNAsasreplacementvectorsexpr reporters.Acomplementationsystemwasestablishedthroughinoculatingthereplacement vectorcarryingGFPgeneasreporter