出口药用植物中双胍辛胺残留量的测定 高效液相色谱法编制说明.docVIP

出口药用植物中双胍辛胺残留量的测定 液相色谱-质谱／质谱法 编制说明 一、标准制定的任务来源及意义 任务来源 依照国家认证认可监督管理委员会国认科函【2010】88号文件，北京局承担研究制订检验检疫行业标准《出口药用植物中双胍辛胺残留量的测定》任务，计划编号为2009B490k。本标准为《出口药用植物中双胍辛胺残留量的测定 液相色谱-质谱／质谱法》。 2．编制意义 双胍辛胺( Iminoctadine)，也称培福朗、派克定、谷种定等C18H41N7，CAS号为13516-27-3，易溶于水和甲醇，急性经口LD50为227~300mg/kg。作用机理与特点主对真菌的类脂化合物的生物合成和细胞膜机能起作用，抑制孢子萌发、芽管伸长、附着胞和菌丝的形成是触杀和预防性杀菌剂。本品属有机氮类杀菌剂，有效成分为双胍辛胺(三乙酸盐)，溶于水。对人、畜中等毒性，对眼、皮肤有刺激作用，对鱼类及水生生物低毒，对蜜蜂和鸟类毒性也较 低。水剂外观为红色或淡黄色透明液体，在常温下贮存稳定2年以上。对多种真菌病害有防效，局部渗透性较强，宜在发病初期使用。标准编写规则 第4部分：化学分析方法(m/z) 子离子(m/z) 双胍辛胺 179 170、158 （2）质谱条件的优化 经过优化，在下列质谱条件下取得较为理想的检测灵敏度。 在MRM监测模式下：毛细管电压3.0 kV，锥孔电压25.00V，离子源温度120℃，脱溶剂气温度350℃，锥孔气流量50 L/Hr，脱溶剂气流量800L/Hr，倍增器电压650V，监测离子、碰撞能量和锥孔电压见表2。 表2 双胍辛胺的MRM分析参数 组分 监测离子对 （Channel Reaction）（m/z） 驻留时间 （Dwell）（s） 锥孔电压（Cone）(V) 碰撞能量 （Collision Energy）(V) 双胍辛胺 *179 ／ 170 0.1 25.0 15 179 ／ 158 0.1 25.0 10 *为定量离子对 （3）色谱条件的选择 根据相关资料，选择了Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC 1.7μm 2.1 mm×100 mm色谱柱。由于文献中对双胍辛胺的流动相主要有乙腈-醋酸铵，乙腈-甲酸溶液以及甲醇-醋酸铵缓冲盐等，经多次实验对比峰形、响应值后采用乙腈：0.5%甲酸溶液 （4:6）作为流动相，保留时间为双胍辛胺1.55min。 仪器测定方法的选择 参考肯定列表附录中双胍辛胺的检测方法，我们尝试了液相色谱（HPLC）结合柱后衍生的方法，该方法是样品经液相色谱分离后、在碱性条件下与茚三酮反应，紫外分光光度计检测，结果发现该方法操作复杂、衍生效率较难控制。而柱前衍生的方法又有灵敏度较低、难以满足实际样品检测需求的问题，因此，本标准采用液相色谱-质谱/质谱仪作为仪器方法。 根据国外双胍辛胺在药草、中药中的限量和本方法的灵敏度，本方法设定定量低限为0.050mg/kg，可以满足肯定列表的最低限量。由于二级质谱良好的选择性和排除干扰的能力，该方法的检测低限仅为液相法的1/4，采用稀释+基质分散固相萃取的方式、用少量吸附剂即可达到净化杂质、提高目标化合物信号的目的，更符合快速高效、灵敏度高、操作简单的检测要求，并且可以同时定性定量检测，因此，本标准采用LC-MS/MS法作为检测方式。浓度为50?ng/mL的双胍辛胺标准溶液的总离子流（TIC）和LC-MS／MS的多反应监测（MRM）色谱图见图2. 图2 双胍辛胺标准溶液（浓度为50?ng/mL）LC-MS／MS的总离子流（TIC）和多反应监测 （MRM）色谱图 五、方法的技术指标 1．线性范围 取双胍辛胺的标准工作溶液进样，进样浓度在0.005 μg/mL-0.100 μg/mL之间，以峰面积对浓度作线性回归分析，线性方程为Y=184.607X+160.439，相关系数r?=0.999955，结果见图3： 图3双胍辛胺标准工作曲线 2．测定低限 测定低限是参考韩国和日本对双胍辛胺的MRL值，按本标准方法所确定的程序采用添加法进行实验室内和实验室间的实测确定的。本方法中测定低限均为0.050?mg/kg，可满足各类进出口药用植物中双胍辛胺残留限量检验和《基本规定》的要求。 3．回收率 本方法以红花、川芎、当归、连翘和银杏叶为样品，采用标准添加法分别进行回收率实验。添加水平见列表3，充分混匀后按本标准确定的操作步骤测定，每个水平重复10次，结果见表3。从表中数据分析结果可见，本方法的回收率实验结果符合《基本规定》的要求。 4．精密度 本方法以红花、川芎、当归、连翘和银杏为样品，采用标准添加法分别进行精密度实验。添加水平见表3，充分混匀后按本标准确定的操作步骤测定，每个水平测定10次，其相对标准偏差结果见表3。 从表中数据分