人类巨细胞病毒UL%2fb′区UL133基因多态性研究.pdf

～ 一 一中一～文一 遁一拭一～要一 人类巨细胞病毒uL／b7区uLl33基因多态性的研究 目 的 人类巨细胞病毒属于B一疱疹病毒亚科，其先天性感染可引起严重的 先天发育畸形及各种新生儿疾病，如新生儿黄疸性肝炎，先天性巨结肠，小 头畸形，智力发育迟缓等，亦可表现为无症状潜伏感染。完整的HcMV基 研究表明HcMV感染的不同临床表现一方面可能与宿主免疫状态有关，而 另一方面也可能与不同临床分离株基因及其编码产物的多态性有关。 不存在，推测ADl69，Towne等实验室株在细胞培养反复传代过程中出现了 uL／b’区遗传信息的丢失和重排，并导致HcMV实验室株复制水平、毒力和 致病力明显减弱，提示这19个0RF很可能在HcMV感染的致病性方面起 重要作用。 本研究主要采用巢式PcR扩增及DNA测序的方法，研究位于HcMv uL／b’区的uLl33基因核苷酸序列及其预测编码产物氨基酸序列的多态 性。 实验材料与方法 1标本来源 ～DNA均为阳性，并排除其他病毒感染。在实验标本中另又加入1l例 ．1． 均保存于一70℃。 2DNA制备 2．1 15000rpm离心15分钟，于一20℃保存作为PcR扩增模板备用。 于1．5rnl试管中，研磨，加入’11E液500斗l、10％SDS10斗l和蛋白酶K5斗l 合均匀后，13000rpm离心15分钟，留取上清液，加入氯仿、异戊醇混溶液 上清液，加入乙醇lrnl及1／10体积3mM rnl 4℃放置1小时后13000rpm离心15分钟。弃去上清液，在沉淀中加入1 燥，加入50斗lddH：o溶解，于一20℃保存作为PCR扩增模板备用。 3．3选取并合成扩增引物 prernier5．0设计针对uLl33基因序列的巢式PCR扩增引物，由上海博亚生 物公司合成， 4PCR扩增 4．1 mixture PcR反应体系10×Buffer5斗l，dNTP 2．5斗1(200mmoL／ (100ng)，用双蒸水补至总反应体积为50斗l。 4．2PcR反应条件本实验采用巢式PcR扩增方法。 在含2％的溴化乙锭(EB)的琼脂糖凝胶上电泳(1×’rAE缓冲液，恒压 80V)30分钟，紫外透射仪下观测结果。 5 PcR扩增产物纯化，回收及测序 将所有等待测序标本进行切胶纯化回收，纯化过程如下：在紫外灯下切 B·衅 出含有目的DNA的琼脂糖凝胶块。向胶块中加入胶块融化液DR—l er，均匀混合后75℃加热融化胶块。加入l／2体积DR一2Bur后，将液体 转移至离心柱中，置于收集管上，3600rpm离心1分钟，弃滤液。加入500斗l Rinse A溶液，3600rpm离心30秒，弃滤液。后加人700出RinseB溶液， ·2· 3600rpm离心30秒，弃滤液。将离心柱重新置于新的收集管上，加入25仙l 于一20qC冰箱中，备测序使用。 PcR扩增纯化产物均采用对应的PCR引物进行双向测序，由上海联合 基因公司完成。 6序列分析 应用软件chromato灯ams阅读测序峰图。全部HcMVuLl33基因编码 区核苷酸及预测编码氨基酸序列均应用BioEdit5．0．O和DNAscar5．1软件 进行分析。各序列之间的同源性由软件MegAlign进行分析计算而获得。 系统进化树分析由软件MegAlign进行计算绘制。翻译后修饰位点应用 NCBIPROS数据库进行分析。 7序列提交 用sequin软件向GenBank提交整理后的HcMVuLl33基因核苷酸序 列。 结 果 1．HcMV uLl33基因编码序列PcR扩增测序结果 22例HcMV临床低传代分离株及