油菜高效再生体系创建及农杆菌介导法基因转化研究.pdf

摘 要 油菜是世界上主要的油料作物，长久以来，育种家对此类作物进行了广泛的品种改良．但 常规育种方法常局限丁|种质资源的匮乏。植物基因工程技术在农业上的应用为有效改良油料作 物提供了新的途径。但从整体上看，油菜遗传转化的效率均不太高，基因转移成功的材料仅局 限在个别品种上。本论文主要以甘蓝型油菜无菌苗子叶和下胚轴为材料，较系统地研究了甘蓝 型油菜子叶和下胚轴外植体高效再生的影响因素、农杆菌介导法甘蓝型油菜转化体系的研究， 试验结果如下。 1．甘蓝型油菜不同子叶外植体的再生以完整子叶．子叶柄外植体再生能力比半子叶．子叶柄 外植体再生能力强；子叶外植体商效再生体系为：以MS为基本培养基，4～5d苗龄子叶外植体 先在含2，4-Dlmg／L的MS培养基上预培养3d诱导产生愈伤组织，再转接到含有BA3mg／L、 芽的分化，子叶外植体的芽再生频率达96．7％。在此再生体系培养基上，子叶外植体接种后第 二天就开始膨大，并在切口处产生愈伤组织。到预培养3d、分化培养7d后．切口处尤其是子 叶柄连接处为坚实、致密的愈伤组织所包围，可见芽的再生，部分外植体产生不定根。分化培 养25d外植体培养结束。 2．不同基因型子叶外植体再生能力不同，以甘蓝型油菜(Brassiea napes)N1品种子叶外 植体芽再生频率最高(83．6％)．其次为埃塞俄比亚芥(B 型油菜(Brapa)R5品种表现为较低的再生能力(10％)，但有较高的再生外植体数目 oleracea)和白菜型油菜(B 塞俄比亚芥(占carinata)介于两者之间。 3，在芸薹属油料作物中子叶外植体较易再生，但不易转化，而F胚轴外植体利于农杆菌介 导的转化。在本试验中F胚轴外植体高效再生体系为：以MS为基本培养基，4—5d苗龄的上端 下胚轴外植体先在含2，4-DI．5mg／L的MS培养基上预培养7d诱导产生愈伤组织，再转接到含 有BA4 mg／L、NAA0，lmg／L和10mg／LAgS203的分化培养基(添加蔗糖30肌，琼脂7．59／L， 8)上诱导芽的分化，下胚轴外植体的芽再生频率为96．7％。 pH5 4．不同基因型在不同培养上下胚轴外植体芽的再生频率变化较人，可以从甘蓝型油菜N3 VII 培养基上没有芽的再生。基因型和培养基与下胚轴外植体芽的再生呈显著性差异，不同培养基、 不同基因型是决定下胚轴外植体芽再生的主要因素。 5．甘蓝型油菜不同类型外植体再生能力不同。花序梗、子叶、F胚轴利真叶柄四种外植体， 以子叶外植体芽再生频率最高(56．7％)，花序梗再生能力最低(仅为10．0％)，其次为下胚轴 (33．3％)和真叶柄(23．3％)；真叶柄具有最高的再生外植体数目(3．23)，其次为花序梗(300) 和子叶(1．57)。利用无菌苗子叶作为外植体具有诸多优点，外植体来源多且不受季节限制，另 外也可减少外植体的污染程度。 6．通过对根癌农杆菌转化多种因素的比较和探索，建立了农杆菌介导的转化体系。以甘 蓝型油菜Nl品种无菌苗完整子叶．子叶柄外植体，预培养2d，经农杆菌EHAl05(含有质粒 51)感染lo~15min共培养48 pDWl 500mg，L培养基上筛选得到转化体，在现有品种上转化频率为2．5％。转化体经PCR检测外源 基因已整合到甘蓝型油菜基因组中，转化植株的大田试验有待于进一步研究。此外，用下胚轴 外植体作为转化受体时未筛选到转化体。这与现有的研究报道不尽一致，也有待于进一步研究。 关键词：油菜：离体培养；子叶；下胚轴：芽再生；农杆菌介导转化 VIll 致谢 值此论文完成之际，谨向我的导师周伟军教授和原导师r守仁教授多年来的言传身教表示 最真挚的感谢!本论文的研究工作是在导师的悉心指导F完成的，在我近四年的博士求学生涯 中，导师在论文的选题、试验的设计以及论文写作的每一个环节都倾注了大量的心血。导师严 谨的治学态度、忘我的工作热情以及开拓创新的科学精神时刻激励着我，将使我终身受益。 British 本论文得到中英(The Council)合作项目、浙江省科技厅、杭州市科技局和国家教 育部等的项目资