特发性血小板减少性紫癜患者激素敏感性与糖皮质激素受体亚型的关系研究.DOCVIP

临床医学论文-特发性血小板减少性紫癜患者激素敏感性与糖皮质激素受体亚型的关系研究 ????????????????????? 作者：朱琦,程毅敏,叶为德,胡钧培 【摘要】? 目的 探究特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者对糖皮质激素敏感性与其外周血单个核细胞内激素受体亚型表达的关系。方法 采用实时定量RTPCR和免疫组化技术检测不同激素敏感性ITP患者（包括糖皮质激素抵抗和敏感病人）外周血单个核细胞内α和β亚型糖皮质激素受体（GRα和GRβ）mRNA和蛋白表达，并将检测结果与正常对照组进行比较。结果 糖皮质激素抵抗组患者外周血单个核细胞GRβ mRNA表达量和GRβ蛋白表达阳性的单个核细胞比率明显高于激素敏感组及正常对照组(P0.01)，而GRα mRNA和蛋白表达水平，各组之间无显著差异。结论 ITP患者糖皮质激素敏感性与其GRβ表达水平密切相关。 【关键词】? 特发性血小板减少性紫癜； 糖皮质激素； 糖皮质激素受体亚型； 激素敏感性 　　1 资料与方法 ??? 1.1 病例选择 40例ITP患者均为我院血液科住院患者，全部病例均经临床和实验室检查，符合ITP诊断标准[3]。40例ITP患者按其对糖皮质激素治疗的反应性分为2组，激素敏感组（强的松足量治疗6周，治疗剂量1.0 mg/kg·d-1，血小板计数≥50×109/L）23例，其中男性8例、女性15例，平均年龄53岁（36~68岁），治疗前血小板平均计数25×109/L（10～37×109/L）；激素抵抗组（强的松足量治疗6周，治疗剂量1.0 mg/kg·d-1，血小板计数＜50×109/L17例，其中男性6例，女性11例，平均年龄52岁（38~70岁），治疗前血小板平均计数24×109/L（11～38×109/L）。两组患者年龄、性别构成、治疗前血小板平均计数，经统计学检验差异无显著性（P0.05）。另外选择20例健康志愿者作为正常对照组，其中男性8例，女性12例，平均年龄54岁（37~69岁），均系我院职工，经临床和实验室检查后排除ITP等血液疾病，在检测前2周，无感染性疾病，并未服用过糖皮质激素或其它免疫抑制剂。 ??? 1.2 标本采集和PBMC分离 空腹抽取ITP患者和健康志愿者外周静脉血10 ml（EDTA抗凝），应用淋巴细胞分离液，按照文献报道[4]的方法，分离收集PBMC待检。 ??? 1.3 实时定量RTPCR检测PBMC内GRα和GRβ的mRNA表达 引物设计：GRα，GRβ和内参照管家基因βactin的特异性引物由英骏生物技术有限公司（Invitrogen Biotechnology Co. Ltd）合成，GRα和GRβ的共用上游引物为：5’ CAA AAC TCT TGG ATT CTA TGC ATG AA 3’；GRα的下游引物为：5’ TTG GAA GCA ATA GTT AAG GAG ATT TTC 3’；GRβ的下游引物为：5’ ATT AAT GTG TGA GAT GTG CTT TCT GG 3’；扩增产物分别为59 bp和70 bp。管家基因βactin的上游引物为：5’CTG GCA CCC AGC ACA ATG  3’，下游引物为：5’CCG ATC CAC ACG GAG TAC TTG  3’，产物大小为68 bp。RNA抽提和逆转录反应：采用RNA抽提和逆转录试剂盒RNeasy Protect Midi Kit及QIAGEN Sensiscript RT Kit，按照试剂盒说明书操作从PBMC中抽提RNA，RNA经定量后，逆转录为cDNA保存。实时定量PCR反应：反应体系为：模板cDNA 0.5 μl，上、下游引物各0.15 μl，含荧光探针的反应混合液SYBR Green master mix （购自Applied Biosystems，ABI）5.0 μl，无菌蒸馏水4.2 μl，总反应体积为10 μl。反应条件：PCR扩增前先于50℃孵育2 min，后再于95℃孵育10 min，随后进行PCR循环，包括95℃ 15s，60℃ 60 s，共40个循环。所有PCR反应均使用ABI PRISM 7900实时定量PCR仪（购自Applied Biosystems，ABI），按照其说明书进行操作，数据由该仪器收集并分析。待测目的基因mRNA表达量计算方法：应用Applied Biosystems公司提供的分析软件，以管家基因β－actin作为内参照，待测目的基因相对表达量以2⊿Ct表示，其中⊿Ct是内参照基因和目的基因Ct值的差值。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。