越桔原花青素对新生大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响.DOCVIP

临床医学论文-越桔原花青素对新生大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响 ???????????????? 作者：沈楠，王艳春，任旷，顾饶胜，范红艳 【关键词】? 原花青素类;心肌；成纤维细胞;一氧化氮;一氧化氮合酶 ??? 0引言原花青素(procyanidin，PC)是越桔重要的生物活性成分，是表儿茶素和表没食子儿茶素的低聚体或多聚体. 有研究［1-3］发现，PC具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老及抗炎症等作用，但对越桔PC药理活性的相关研究还少见报道. 本研究以血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导心肌成纤维细胞(CFb)增殖，观察越桔PC对CFb诱导型一氧化氮合酶 一氧化氮(iN0SNO)系统的影响，以探讨PC抑制CFb增殖的初步机制. ??? 1材料和方法 ??? 1.1材料Wistar大鼠30只，1～3日龄（吉林大学基础医学院实验动物中心）；越桔原花青素（南京苏朗医药科技开发有限公司）; AngⅡ和MTT（美国Sigma公司）；IMDM，血清（GIBCO公司）；iNOS一抗（Santa cruz公司）;胰蛋白酶（宝泰克生物科技公司）;羟脯氨酸试剂盒，iNOS试剂盒（南京建成生物工程公司）;TGFβ1 ELISA试剂盒（晶美生物工程有限公司）；NO试剂盒（碧云天生物技术研究所）；SP试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）；FITC羊抗兔Ig（北京中杉金桥生物技术有限公司）. ??? 1.2方法 ??? 1.2.1细胞分离与培养Wistar大鼠无菌开胸取心肌, DHanks液清洗,剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎片，20 mL/L胰蛋白酶反复消化(37℃水浴,8 min/次),分别收集各次消化上清液，1000 r/min,离心5 min，弃上清,用含10 mL/L血清的IMDM培养基重悬沉淀制成细胞悬液,接种培养瓶中,置37℃，50 mL/L CO2培养箱内培养. 用差速贴壁法去除内皮细胞及心肌细胞. 实验采用第3～5代细胞. ??? 1.2.2实验分组与处理CFb细胞分为： 对照组，模型组，PC药物治疗组. 各组细胞无血清培育24 h后，除对照组外均给予终浓度为1×10-7mol/L的AngⅡ，药物治疗组同时给予PC，终浓度分别为25，50，100 mg/L，对照组给予10 mL/L血清的IMDM培养基. ??? 1.2.3MTT法检测将CFb以1×108/L个细胞密度接种于96孔板,每孔200 μL. 分别给予不同的处理因素作用48 h. 每孔加入MTT溶液（5 g/L） 20 μL，37℃继续培养4 h，终止培养，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min后，酶标仪490 nm波长处，测吸光度(A)值，以（各实验组A值/对照组A值）×100%表示细胞增殖率. ??? 1.2.4TGFβ1蛋白及胶原含量测定各因素处理后，分别在培养的24和48 h吸取细胞上清液，按照试剂盒操作说明测定TGFβ1蛋白含量及胶原含量. ??? 1.2.5NO含量、iNOS活性测定各处理因素与CFb共孵育6 h. 检测细胞上清夜中NO含量及iNOS活性的变化. 实验操作按NO,iNOS试剂盒说明书进行. ??? 1.2.6免疫荧光细胞化学染色将CFb加入到预先放置盖玻片的24孔板，各因素作用6 h. 将生长有CFb的盖玻片取出，PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定30 min,山羊血清室温封闭30 min；滴加一抗（兔抗大鼠,1∶50稀释）4℃过夜;PBS洗3次;再滴加FITC标记的二抗(羊抗兔),37℃ 1 h, PBS洗15 min×3次;观察并拍照. 用ImagePro Plus图像分析软件（Media Cybernetics公司）检测平均吸光度值. ??? 统计学处理：实验数据以x±s表示，组间比较采用方差分析及q检验进行. P0.05为差异具有统计学意义. ??? 2结果 ??? 2.1PC对CFb增殖、胶原代谢及TGFβ1的影响与对照组相比较，AngⅡ模型组细胞增殖率、羟脯氨酸含量、TGFβ1含量均有增加（P0.01）. PC在25，50，100 mg/L剂量时可抑制细胞增殖；降低羟脯氨酸及TGFβ1含量；与AngⅡ模型组相比较差异具有统计学意义（P0.05或P0.01，表1）. ??? 2.2PC对iNOS蛋白表达、活性及NO含量的影响对照组CFb具有iNOS蛋白表达及活性,能够合成NO. AngⅡ模型组CFb iNOS蛋白表达减少、活性降低,NO的含量减少，与对照组比较差异具有统计学意义(P0.01). 各PC药物治疗组均可增强CFb的蛋白表达及活性，提高NO含量，与AngⅡ模型组比较差异具有统计学意义（P0.05，表1）.表1原花青素对CFb增殖、胶原代谢、TGFβ1及iN0SNO系统的影响 ??? 3讨论心