LRP与Vault结构的初步研究.pdfVIP

中文 摘 要 前 言 俗。体。Vault)、量*13MD.由三种。白MVP(，要，。 体蛋日majorvaultprotein，也叫肺耐药蛋白，lungresistancepr-o tein，简称LRP),TEP1(端粒酶相关蛋白1,telomerase一associated protein1),vPARP(vault一associatedPARP)和一种小分子量的VR- NA(vault一associatedRNA)组成。大多数真核生物都有这一结 构，在电镜下呈椭圆型，由两个相互对合且对称的弯隆样结构组 成，每个弯隆样结构又由8个花瓣样结构组成，与核孔复合物，输 送小泡及细胞骨架，肿瘤耐药及激素受体均有关，但其具体的生物 学功能尚不清楚。 现已发现TEP1和vRNA并非形成vault结构所必需 在本实 验中，我们发现LRP可以单独形成vault结构，进而再与 他成分 结构所 结合;而vPARP象TEP1和vRNA一样，也不是形成Vault 必需的。 厂 实验材料 火细粒分析纯蔗糖,2一N一Morpholinoethanesulfonicacid( MES),GSH一Sepherose一4B,GSI.单克隆抗体，马抗兔I薛，羊抗 鼠IgG,LRP抗体，ECLWesternBlot检测系统;LB培养液，含蔗糖 5%-60%的MES溶液，考马斯亮蓝染色用固定液、染色液、脱色 液。日立CF7D离心机，日立CR21F离心机，日立55P-72S超高 速离心机，RPS65T一347转头，TOMYUD一200型超声粉碎机， BIORADPOWERPAC200电泳仪，BIORAD干式转移仪，TEFCO启 ·1· 然于胶系统。 实验方法 一、蛋白的表达与制备: 融合蛋白ProteinC一LRP和GST一vPARP一C由本实验室通 过将LRPcDNA和vPARPC末端cDNA分别载人pXB和pGEX- 4T一1载体内，转化大肠杆菌DH5a,筛选而来。 将表达融合蛋白ProteinC一LRP和GST一vPARP一C的 DH5。分别置于150mlLB中并加人0.2mMIPTG,22℃过夜培养。 次日4℃收集菌体沉淀，加人MES进行超声粉碎后离心，收集上 清，一80℃保存。 二、Pull一do，实验: GSH一Sepheros。一4B与GST一，PARP一C混合，4℃反应2小 时，离心所得沉淀即为GST一vPARP一Sepherose一4B;取ProteinC 一LRP分别加人到GST一vPARP一Sepherose一4B和GSH- Sepherose-4B中，4℃反应2小时，离心去上清，在该沉淀及Pro- teinC一LRP粗蛋白中加人5xSDS上样缓冲液，100℃加热5分 钟，行7.5%变性聚丙烯酞胺凝胶(SDS一PAGE)电泳及Western Blot(同方法五，一抗为抗LRP抗体)。 三、GST一vPARP一C同ProteinC一LRP的结合实验: 在ProteinC一LRP,GST一vPARP一C及二者的混合液中各加 人1%Aprotinin及少许APMSF粉末。4℃充分反应2小时后，各取 0.5ml进行二次不连续蔗糖密度梯度离心。 四、不连续蔗糖密度梯度离心: 蔗糖浓度分别为60%-5%的MFS缓冲液各0.5m1，由下至 上逐层加人离心管中，蛋白样品最后铺于已建立的梯度缓冲液之 上。4`C20000xg离心1小时。取5%浓度的部分铺于10% - ·2 · 60%的密度梯度离心管中，4C920000xg离心16小时。 五、蛋白免疫印迹(WesternBlot): 离心后将样品逐层取出后，各取20闪与5xSDS上样缓冲液 6川混合，100℃加热5分钟后，进行WesternBlot检测LRP及 vPARP一C在各浓度梯度的分布。