RNAi沉默Bcl2基因抑制膀胱癌生长实验研究.pdfVIP

◇耋然曼 擒要 RNAi沉默Bcl．2基因抑制膀胱癌生长的实验研究 专 业： 外科学(泌外) 博士研究生： 许可慰 导 师： 黄健教授 摘 要 研究背景 膀胱癌是我国泌尿男生殖系最常见的恶性肿瘤，其中移行细胞癌占900以上。 由于缺乏特异性的肿瘤标志物，目前膀胱癌难以做到早期诊断；且现有的手术、 化疗或放疗等治疗措施对膀胱癌的疗效不够理想，表浅性膀胱癌患者术后复发率 的五年生存率不足50％。因此，亟待对膀胱癌的肿瘤发生发展机制做更深入更广 泛的研究，并从中探索治疗膀胱癌的新途径。 凋亡(apoptosis)调控紊乱在膀胱癌的研究中受到越来越多的重视，进一步 阐明膀胱癌细胞凋亡的调控机制正成为膀胱癌领域的研究热点。在肿瘤的发展进 度表达或突变、缺失，导致凋亡调控紊乱，促进了恶性细胞的无抑制性生长。文 瘤细胞凋亡起着重要的调控功能；已有研究探讨这些凋亡调控因子与膀胱癌发生 发展的关系，但还存在不少争议；它们很可能在膀胱癌的发展进程中也起关键作 用。尽管Bcl-2与膀胱癌的关系尚无定论，有学者已经通过反义RNA来抑制Bcl-2 的表达，提高了膀胱癌耐药细胞株对顺铂的敏感性。可见，以Bcl-2为靶点的治 疗将能从促进细胞凋亡和逆转化疗耐药性等方面达到抑制膀胱癌的目的。因此本 课题的第一部分采用免疫组织化学法检测膀胱移行细胞癌组织(bladder transitionalcell @中’删懑 探讨其临床意义，为下一步探索以细胞凋亡调控为切入点的膀胱癌新的治疗途径 提供依据。 尽管抗Bel-2的治疗策略在肿瘤治疗领域具有广阔的前景，但目前还缺乏行 之有效的方法来高效特异地抑制肿瘤细胞Bcl-2的表达，从而达到抗肿瘤的最终 目标。新兴的RNA干扰(RNA 定、特异的基因阻断作用，为实现抗Bcl-2的肿瘤治疗策略提供了可能。本研究 siRNA 的第二部分是运用RNAi技术，以凋亡抑制基因Bcl-2为靶基因，构建Bcl-2 的真核表达载体，并在膀胱癌细胞株进行体外实验检测其沉默Bcl-2表达的生物 学效应。本研究的第三部分则进一步构建膀胱癌的动物模型，在荷瘤动物体内探 讨Bel-2siRNA的抗肿瘤效应，为今后进一步开展膀胱癌基因治疗提供实验基础。 第一部分膀胱移行细胞癌组织中Bcl-2、Survivin、突变型p53的 表达及临床意义 的表达、相关性及临床意义。材料和方法：应用免疫组织化学链酶卵白素一过氧 型p53蛋白的表达，并与15例正常膀胱黏膜组织进行对照研究。结合临床与病理 资料，分析各指标与肿瘤进展的关系。结果：78例BTCC中，Bcl-2蛋白的阳性 与BTCC的病理分级、临床分期以及有无复发史显著相关(Po．05)．突变型p53 蛋白的表达与BTCC的病理分级、临床分期以及有无复发史无关(Po．05)。根据 相关，Bcl-2和Survivin的过度表达提示膀胱癌高危。 第二部分Bel-2siRNA真核细胞表达载体的构建与沉默Bel-2基因 抑制人膀胱癌细胞生长的体外实验 n ◇中T怂曼 摘娶 人膀胱癌细胞株生长的影响，并筛选出能够起显著干扰效果的sLRNA序列。材料 和方法：根据GcnBank提供的Beb2 计原则，设计合成3对针对Beb2 pGenesil-1--Be92 观察重组质粒对Bcl-2mRNA表达的干预情况：WesternBlot检测重组质粒对Bob2 蛋白表达的影响；MTT法观察重组质粒对T24细胞体外生长的抑制作用； siRNA重组质粒经双酶切和测序鉴定，符合设计 结果：构建的pGenesibl--Bel-2 要求。Beb2 之后，细胞的活力显