重组质粒载体pCMVLRIG2转染BIU87细胞株的效应研究.DOCVIP

临床医学论文-重组质粒载体pCMVLRIG2转染BIU87细胞株的效应研究 ??????????? 作者：李国灏，杨为民，叶章群，文博，刘征，郭东生 【关键词】? LRIG2；膀胱肿瘤；效应；Westernblot；RTPCR ???? LRIG2基因是新近发现的一组基因——LRIGs基因的一种，他们编码的产物是一类结构相似的跨膜糖蛋白，在其胞外段有多个亮氨酸重复序列和Ig样结构域(tandem leucinerich repeats and immunoglobulinlike domains, LRIG)[12]。研究发现，在多种肿瘤组织内有LRIG2基因表达水平的下调[23]。基于上述研究结果，我们拟通过基因转染技术，将外源性LRIG2基因导入膀胱肿瘤细胞株并进行筛选，观察转染后LRIG2基因对膀胱肿瘤生长能力、侵袭力及黏附力等生物学行为的影响。 ??? 1? 材料与方法 ??? 1.1? 试剂来源? 膀胱肿瘤细胞株BIU87由我科实验室冻存；携带有LRIG2全长mRNA的重组质粒载体pCMVLRIG2及兔抗人LRIG2蛋白多克隆抗体由瑞典Umea大学Hakan Hedman教授惠赠，该质粒携带有LRIG2全长mRNA及其终止序列，因而能够在真核细胞内表达LRIG2蛋白但不能表达GFP蛋白，故转染后的细胞不能产生绿色荧光；羊抗兔IgG二抗购自晶美公司；1640培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自四季青公司；限制性内切酶EcoRⅠ购自TaKaRa公司；质粒小量及大量提取试剂盒购自Omega公司；脂质体Lipofectamine2000购自Life Technologies公司；蛋白提取试剂盒购自Pierce公司；Transwell培养板购自Corning公司；基质胶购自Sigma公司。 ??? 1.2? 细胞培养? BIU87细胞株用含有10%(体积分数)胎牛血清(杭州四季青公司)的1640完全培养基在37℃、5% CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。 ??? 1.3? 质粒的小量提取与酶切鉴定? 将重组质粒载体pCMVLRIG2转化入感受态大肠杆菌DH5α菌株内，常规铺板，挑取菌落，扩增，采用质粒小提试剂盒提取质粒。用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，10g/L琼脂糖凝胶电泳。 ??? 1.4? pCMVLRIG2转染BIU87细胞? 将BIU87细胞以1×106接种到6孔板中，待其生长到90%融合时，应用脂质体Lipofectamine2000按试剂盒说明书进行转染，分为空白组BIU87(未转染)、对照组BIU87GFP(转染pEGFPN1)和实验组BIU87LRIG2(转染pCMVLRIG2)3组。 ??? 1.5? 转染细胞的筛选? 转染48h后用含有800μg/mL G418、10%(体积分数)胎牛血清的RPMI 1640进行筛选，隔天更换一次培养液，待对照组细胞全部死亡(1周)后，换G418浓度为400μg/mL的培养液维持培养。2-3周后，生长出抗性克隆。经扩大培养、连续传代1-2个月，继而进行其他各项指标的检测。 ??? 1.6? 蛋白的提取及Western Blot分析? 收集3组细胞，应用动物蛋白提取试剂盒分别提取3组细胞的总蛋白，12000g离心15min，将上清转管于-80℃冻存。采用Bradford法测量蛋白浓度后，在8%(80g/L)SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳，上样量为30μg总蛋白。电泳后，使用电转移仪将样品转至PVDF膜。用含5%脱脂奶粉室温封闭2h，分别加入LRIG2兔抗人多克隆抗体(1∶50)、EGFR兔抗人多克隆抗体(1∶2000)室温作用1h。洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1∶1000)，室温作用1h。洗膜，压片，放射自显影。 ??? 1.7? 细胞生长曲线的测定? 用2.5g/L的胰酶将3组细胞分别消化成单细胞悬液，调整细胞数为1×103/mL，接种于96孔板，并加含10%(体积分数)胎牛血清的RPMI 1640培养液150μL，每组设24个复孔，未接种细胞的孔作空白对照。置于37℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。每天各组取3孔用MTT比色法进行检测，参照波长630nm，检测波长570nm，根据测定的A值绘制细胞生长曲线。 ??? 1.8? 细胞侵袭力测定? 采用Transwell法进行检测。用2.5g/L的胰酶将3组细胞分别消化成单细胞悬液，调整细胞数为1×106/mL；用1mg/mL基质胶铺于8μm孔径的Transwell微孔滤膜上，下室加入2.6mL(含200μL趋化剂)10%(体积分数)胎牛血清培养基，将肿瘤细胞悬液以每室1.5mL加入上室，培养24h后，去除滤膜上层细胞行HE染色。镜下(