亚洲黑熊血液相关成分的初步研究及其MHC II类基因多态性分析.pdfVIP

论文摘要 输血是近代医学巨大成就之一，挽救了大量因严重失血或贫血而生命垂危的 病人。安全输血的前提是配合性输血，只有交叉配血的结果完全相符，即供患者 血型相容才能进行输血。自1901 年K.Landsteiner 发现了人类的ABO 血型系统 以来，人类血型经过100 多年的研究，共有270 个公认的血型抗原被发现，相关 研究已经非常深入完善，但是对动物血型和输血方面的研究则相对较少。研究动 物的血型，首先需对其血液相关成分、生化指标及基因进行分析。本研究选择了 亚洲黑熊作为研究对象是因为亚洲黑熊是国宝大熊猫的近亲，对亚洲黑熊血型研 究的成果和经验可为大熊猫血型的研究提供非常有用的信息。 本文主要从以下几个方面对亚洲黑熊血样进行了研究： 1. 亚洲黑熊血浆中同种免疫性血型抗体（IgM，IgG）的检测分析 通过红细胞血凝试验检测亚洲黑熊血浆中的IgM 血型抗体。结果显示，在所 检测的33 只黑熊血样中发现，有2 只黑熊的血浆中，存在比较明显的IgM 类血 型同种抗体，该抗体与75%的黑熊红细胞发生特异性抗原抗体反应，并导致红细 胞凝集。通过Polybrene 方法进一步对亚洲黑熊血浆中的IgG 型血型抗体进行检 测，可能是由于血浆中抗体的浓度较低，加上现有的检测方法都是针对人的红细 胞血型抗体，而亚洲黑熊的红细胞同人的红细胞在膜电位和凝集的最佳溶液离子 强度等方面存在差异,在两次采集的黑熊血浆中，本研究都均未发现存在明显的 IgG 类血型同种抗体。 2. 抗黑熊IgG 抗体的制备及黑熊血型IgG 同种抗体间接抗球蛋白试验分析 提取亚洲黑熊血浆中的免疫球蛋白IgG，并制备兔抗熊IgG 抗体。利用饱和 硫酸铵法对亚洲黑熊血浆中的免疫球蛋白进行分离提取，得到免疫球蛋白的粗提 物透析3 次进行浓缩，得到较高纯度的免疫球蛋白。将浓缩后的样本免疫新西兰 大白兔，经过4 次免疫后，ELISA 检测抗血浆效价1：512，最终用protein A 纯化抗血浆得到兔抗熊IgG 抗体。 利用该兔抗熊IgG 抗体，对第二次采集的33 只黑熊血样的红细胞和血浆分 別经两两交叉混合后，检测其血浆中上是否存在IgG 血型同种抗体。结果，未发 I 现明显的IgG 类血型同种抗体。 3. 亚洲黑熊红细胞膜电位测定与比较 膜电位对维持红细胞各种生理活动正常进行起着重要的作用，研究亚洲黑熊 红细胞静息膜电位对于其红细胞的保存及相关反应条件的确立有重要意义。本研 究采用膜电位荧光染料双(1,3-二巴比妥酸)-三次甲基氧烯洛尔（DiBAC4(3)）进 行膜电位的测定。用DiBAC4(3)测定得到人红细胞静息膜电位为-10.67± 0.54mv，与膜片钳测得的数值相吻合，说明荧光染料DiBAC4(3)测定的膜电位比 较可信。用这种方法测得亚洲黑熊红细胞的静息膜电位为-12.35mv。 4. 亚洲黑熊MHC Ⅱ类分子DRB、DQA 基因多态性分析 提取亚洲黑熊血液基因组DNA，选取主要组织相容性复合物(MHC)II 类分子 中多态性最高的DRB 和DQA 位点的第二外显子序列作为分析区域，采用PCR 扩增 和克隆测序等方法对40 只亚洲黑熊的DQA 和DRB 位点的第二外显子序列进行了 多态性分析。在40 只亚洲黑熊样本中检测出了9 种DQA 第二外显子等位基因和 13 种DRB 第二外显子等位基因，相对于大熊猫，亚洲黑熊的DQA 和DRB 具有很 高的多态性。通过对氨基酸序列抗原结合位点的同义替换和非同义替换的比较， 证明了DQA 和DRB 位点的平衡选择作用。 关键词：亚洲黑熊，血液，免疫球蛋白，膜电位，主要组织相容性复合物，流 式细胞仪 II ABSTRACT Transfusion is one of the great achievements in modern medicine, which has saved a lot of patients due to blood loss or severe anemia. The premise of transfusion safety is to check