活性氧清除基因及果胶裂解酶基因对禾谷镰孢菌致病性影响的研究.pdfVIP

摘要 摘要 禾谷镰孢菌是子囊菌门的丝状真菌，有性态为玉蜀黎赤霉，能侵染小麦、大 麦、水稻、燕麦等禾谷类作物的穗、茎、茎基部和根部等部位，引起穗腐、茎腐、 茎基腐和根腐病等病害，对农业生产造成巨大的损失。多年以来，科研工作者一 直试图寻找有效且环境友好的控制方法，但都收效甚微。了解禾谷镰孢菌侵染寄 主时的关键毒力基因，从致病菌的角度去了解植物与真菌相互作用的过程，将有 助于寻找到新的抗病靶位点。 通过分析禾谷镰孢菌侵染寄主小麦胚芽鞘的动态基因表达谱，发现了一个在 侵染时期特异性高表达的Cu-Zn SOD (SOD1) 。在野生型禾谷镰孢菌中组成型表 达SOD1-RFP ，发现其定位于真菌细胞内部。通过构建重组蛋白表达载体，获得 纯化后的蛋白，并用于体外酶活测定实验，结果证实该基因所编码的蛋白就是 Cu-Zn SOD 。运用基因敲除技术，获得该基因的单基因敲除突变体，并对其进行 了多项表型分析，结果显示该蛋白能够保护禾谷镰孢菌抵抗胞内超氧阴离子的胁 迫，且突变体较野生型菌株的致病力明显变弱。 本研究中意外发现SOD1 突变体在H O 环境中会出现萌发变缓的现象，而 2 2 利用DAB 对受到侵染的寄主小麦胚芽鞘进行H O 染色，也能看到明显的着色 2 2 块。这些结果就预示着禾谷镰孢菌需要抵抗外界H O 的武器。 2 2 再次分析禾谷镰孢菌的基因表达谱，我们找到了一个在侵染寄主早期特异性 高表达的基因CAT1，该基因具有一个明显的信号肽及catalase 功能域。在野生 型禾谷镰孢菌中组成型表达CAT1-RFP ，发现其定位于真菌细胞壁。通过构建重 组蛋白表达载体，获得纯化后的蛋白，并用于体外酶活测定实验，结果证实该基 因所编码的蛋白就是Catalase 。运用基因敲除技术，获得该基因的单基因敲除突 变体，并对其进行了多项表型分析，结果显示该蛋白能够保护禾谷镰孢菌抵抗外 界H O 胁迫，且突变体较野生型菌株的致病力明显变弱。 2 2 本研究中亦构建了上述两个基因的双突变体，对双突变体进行致病力检测， 结果显示其毒力较野生型及单基因突变体都有所下降。 果胶裂解酶是果胶酶的重要成员之一, 能够通过β-消除作用, 催化降解 I 摘要 (1→4)-α-D-聚半乳糖醛酸。PelA 基因(FGSG_02386), 的cDNA 被克隆并进行了 原核表达, 同时构建了单基因敲除突变体。将重组质粒pET-28a(+)-PelA 转化蛋 白表达菌株大肠杆菌BL21 表达目的蛋白, 纯化后的蛋白具有果胶裂解酶活性。 酶活性测定结果显示, 该酶的活性受到外界环境因素如温度、钙离子浓度和pH 条件的影响, 其最适反应条件为50 ℃, CaCl 浓度0.5 mmol·L-1, pH 8.5 。在侵染 2 小麦胚芽鞘时PelA 单基因突变体的毒力较野生型菌株并没有出现明显变化。 综上所述，利用基因敲除、酶活测定和快速致病力检测的方法验证了一个 Cu-Zn SOD 、Catalase 和PelA 的功能。发现Cu-Zn SOD 和Catalase 是禾谷镰孢 菌毒力相关基因，参与抵抗真菌侵染寄主时所面临的ROS 胁迫。而且本研究首 次鉴定出禾谷镰孢菌中的一个果胶裂解酶PelA, 并在体外检测了其生化特性。 关键词：禾谷镰孢菌；Cu-Zn SOD ；过氧化氢酶；果胶裂解酶