绛红色小单孢菌+G1008+中+gntK+基因的研究.pdfVIP

绛红色小单孢菌G1008中gntK基因的研究 严凌斌洪文荣幸方志锴 (福州大学生物科学与工程学院，福建福州350108；) 摘要：本研究在构建了绛红色小单孢菌(Micromonosporapurpurea)高效接合转移体系的基础上，利用红 通过对该工程菌株的代谢产物进行薄层层析分析，初步推测该基因为一个C．6’位上的甲基化酶基因。 关键字：绛红色小单孢菌：gntK基因；结合转移；庆大霉素 中图分类号：Q933文献标识码：A 小单孢菌可产生多种生物活性物质，特别是氨基糖苷类抗生素，如庆大霉素、西索米星和福提米星等 【11，它们是临床上广泛使用的基本药品。但由于小单孢菌遗传性能的特殊性，使得对其分子生物学的研究 大大落后于链霉菌【2】。国内对小单孢菌次级代谢生物合成机制的研究报道的很少。 庆大霉素是重要的抗感染药物，已在临床上应用了近半个多世纪。其产生菌：绛红色小单孢菌，是特 还有十分丰富的其它小组分，可开发产品有庆大霉素A，B，X系列等。庆大霉素B是进一步合成抗耐药 菌药物异帕米星的母体【4】，庆大霉素A、B、X是进一步开发抗原虫药物的良好母体【5】。庆大霉素Cla是进 一步合成抗耐药菌药物依替米星的母体【6】。由于庆大霉素C复合物结构相似，理化性质接近，因此层析分 离Cla非常困难，满足不了市场需要，出现了供不应求的局面。目前迫切需要解决能够生产大量Cla的药 用微生物。 据推测，庆大霉素的生物合成过程中涉及到两次非活性C上的甲基转移反应【7】，而朋敝产物可能调节 C．6’位上的甲基化，是控制C1和C2的合成的关键。若阻断朋Ⅸ，则代谢流可能只流向Cla，从而获得组 分相对单一的Cla，既简化了生产工艺，降低生产成本，同时也更便于进行产品的质量控制。但由于对小 单孢菌进行遗传操作较为困难，至今明Ⅸ的功能还未得到验证。本研究在建立了对小单孢菌高效的接合 转移体系基础上，实现对该基因的置换，检测工程菌株的代谢产物，以研究基因功能。 1材料与方法 1．1材料 coli coli Topl0，接合转移供体菌E ermE)质粒，由上海医药工业研究院邵雷博士惠赠。克隆载体pMDl9-T购自Takara公司。 1．1．2抗生素与培养基绛红色小单孢菌斜面培养基：麸皮1．2～1．6％，可溶性淀粉0．75％，天冬素 0．03％，NaCl 0．05％，KN030．1％，K2HP04 0．05％，CaC030．1％，琼脂1．8％，pH7．5。 0．002％，MgS046H20 绛红色小单孢菌种子培养基：葡萄糖0．1％，玉米淀粉1．O％，玉米粉1．5％，蛋白胨O．2％，黄豆饼粉 I．O％，KN030．05％，CaC030．5％，pH7．0。 189 0．01％， 绛红色小单孢菌发酵培养基：玉米淀粉4．0％，玉米粉1．o％，蛋白胨O．4％，黄豆饼粉2．5％，KN03 (NH4)2S040．1％，CaC03O．5％，淀粉酶0．025％，COCl2 10r／ml(10r=lO击)，pH7．5。 O。1 孢子预萌发培养基：Difco酵母膏1％，Difco酪蛋白氨基酸1％，CaCl2M(需配制5M的原液，分 开灭菌后加到酵母膏／酪蛋白氨基酸溶液中去)。 培养细菌的LB培养基参见文献【810 25 LB培养基中抗生素终浓度：氨苄青霉素100I．tg／mL，安普霉素50pg／mL，氯霉素 I-tedmL， 卡那霉素25 lxg／mL；接合转移培养基中