肠出血性大肠杆菌O157：H7Tir基因的克隆、表达及生物学活性研究.pdfVIP

人兽共患病一细菌病 肠出血性大肠杆菌0157：H7Tir基因的克隆、表达及生物学活性 研究水 张雪寒何孔旺周俊明温立斌茅爱华倪艳秀郭容利俞正玉 吕立新 (江苏省农业科学院兽医研究所，农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，国家兽用生物制品工程技术研究中 心，南京210014) 原核表达载体，体外构建Tir原核表达重组菌，并在大肠杆菌中获得高效表达。以Tir免疫家兔获得了高效价多克隆 抗体，westem blot分析此抗体能与Tir发生特异性抗原抗体反应。选用Hep．2细胞对Tir重组蛋白进行粘附特性分析， 示表达Tir蛋白具有良好的免疫原性和反应性和一定的免疫保护性。在大肠杆菌中成功克隆表达了1_ir基因，所获Tir 具有良好的抗原性，可能用于肠出血性大肠杆菌0157基因工程疫苗的研究。 关键词肠出血性大肠杆菌0157：H7；转位紧密素受体；基因表达；免疫保护 食源性病原微生物是当今世界上不断增多的食品安全和突发性公共卫生事件的主要诱因。其中， Esch翻chia 肠出血性大肠杆菌(Enterohaemon．hagic 炎、还可在5％～10％的病例中引发溶血性尿毒综合征及血栓性血小板减少紫癜等严重并发症，严重 者可致死亡。近20余年来，EHEC0157：H7引发的食物中毒在世界各地包括我国都有不同规模的 暴发流行【l一4】。目前对其感染尚缺乏有效的防治方法。研究证明抗生素可促使0157菌释放致死性 ureIIlic 志贺毒素(StX)，从而使患者并发溶血性尿毒综合征(Hemolyticsyndrome．HUS)的危险性增加。 因此，研制出有效的针对性防治方法如疫苗对防治0157：H7的感染有着极其重大的意义。 intirnin 转位紧密素受体(Trallslocation 素结合发挥作用。该蛋白通过EHEC IIISecretion III型分泌系统(type System，TTSS)分泌并转位至宿 主细胞中【5—6】，在EHEC 氨基酸。本实验拟克隆表达EHEc 希望获得对EHEC0157：H7感染具有一定免疫保护作用的基因工程亚单位疫苗。 1材料和方法 1．1材料 1．1．1菌种和质粒 EHEc0157：H7 北京天为公司；E∞“BL2l(DE3)，本室保存。 1．1．2试剂 (Yeastex仃act)(OXOID公司)；励mH I和月西彬Ⅲ(础叔a公司)；DNA纯化试剂盒(TakaRa公司)。 1．1．3实验动物 家兔购自江苏省农业科学院畜牧所种兔场：Balb见小鼠购自扬州大学。 1．2引物设计和基因克隆 根据GeIlBalll(中0157：H7 物5’端分别引入勘珑H I和Hf蒯IⅡ酶切位点(下划线处)。常规方法进行PCR扩增，参数如下：94℃， 5min；94℃，1min，60℃，30s，72℃，l。5min，30cycles；72℃，10rIlin。 PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离后，紫外灯下切割目的条带，用DNA纯化试剂盒回收PCR 产物，并用勘肌HI和Ⅳ俐III酶切3h，胶回收目的片段，与砌，，zH I和日涮III酶切pET28a质粒载体连 接，转化大肠杆菌Topl0感受态，通过卡那霉素抗性和限制性内切酶酶切进行筛选和签定。 上述经过鉴定为阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用于后续蛋白表达。 l柏0 第十三次学术研讨会会议论文集 1．4 t组蛋白的诱导衰达和纯化 在平板上挑阳性克隆转接于含有卡那霉素的LB液体培养基，收集细菌进行SDs．PAGE。收集诱 000 导表达的重组菌进行冰浴超声破菌，直至菌液呈现透明状态为止，12 g