玉米两个RFLP标记的原位单杂交与共杂交定位的比较.pdfVIP

遗传 HEREDITAS(Beijing)21(1):35--401998 基因靶位操作的技术与应用 汪亚平 朱作言 （中国科学院水生生物研究所，武汉 430072) TheApproachandApplicationofGeneTargeting WANGYa-Ping ZHUZuo-Yan (InstituteofHydrobiology,TheChineseAcademyofSciences,Wuhan430072) 1基因靶位操作的筛选系统 哺乳类细胞基因靶位操作中，同源重组效率低下是其主要技术障碍。在HPrt基因的模型研究基础上，逐渐 形成基因靶位操作筛选策略框架 1-〔33。80年代中期，发展了多种筛选策略，以满足哺乳类细胞内源非选择性位 点的基因靶位操作研究。这些方法可分为两类：物理筛选方法和遗传筛选方法。 1.1物理筛选方法 PCR方法建立以后，很快应用于基因靶位操作中转化子的筛选。通过在目的突变基因中引人特定的PCR引 物顺序，利用PCR方法直接检测转化细胞组份或细胞克隆的DNA结构，以特定扩增DNA片段的有无，鉴别 同源重组细胞克隆。Kim和Smithes首先应用PCR方法成功筛选出ES细胞Hprt基因的定点突变克隆 〔〕‘。随 后，Joyner等应用同样的方法，对小鼠ES细胞的en-2基因进行了定点突变 ’〔〕；Zimmer等用PCR方法筛选 出同源异型盒基因hoxl.l定点突变的ES细胞克隆，并得到含该突变的嵌合体小鼠(6) 1.2遗传筛选方法 1.2.1正向筛选方法 正向筛选方法通过基因靶位操作特殊的载体设计，使正向选择基因仅在同源重组转化子 中表达，从而可在选择培养基中筛选转化子细胞克隆。鉴于这一特殊设计，正向筛选方法只适用于在靶细胞中能 正常表达的基因。正向筛选方法的载体设计涉及基因表达调控的两个主要元件，启动子和转录终止顺序。 (1）启动子缺失筛选方法：在基因靶位操作载体的目的基因片段中插入启动子缺失的正向选择基因neo,目 的基因片段亦不包括该基因的启动子区域。目的突变基因片段与基因组靶位基因间的同源重组，使正向选择基因 能在基因组靶位基因启动子的驱动下，表达功能性基因产物，使转化子细胞具有G418抗性，从而可在G418培 养基中筛选出同源重组细胞克隆。考虑到neo基因在转化细胞中的有效表达，neo基因可以两种方式插人载体目 的基因片段中：或者以一致的阅读匡插人目的基因片段中，或者在neo基因翻译起始码5上‘游引人翻译终止码。 前者将在基因组靶位基因启动子驱动下，表达，teo基因的融合蛋白，使转化细胞具G418抗性C,8)，后者则通 过核糖体重启动或翻译起始表达独立的。eo基因产物，转化细胞将同样获得G418抗性表型(9,10) 图（1,A). 采用启动子缺失筛选方法，Charron(8)等定点突变了小鼠ES细胞N-myc基因，在G418抗性克隆中有高 达20％的克隆来自同源重组．Schwartzberg等用启动子缺失方法成功筛选出ES细胞c-abl基因定点突变克 隆7)〔，通过胚胎嵌合体途径研制出基因定点突变小鼠川〕。 (2)PolyA缺失筛选方法：PolyA缺失筛选的载体设计与启动子缺失筛选类似，polyA缺失的正向选择基 因neo置于载体的目的基因片段中，rteo基因因缺失转录终止信号，其表达在转录水平受到抑制。在同源重组的 细胞中，lteo基因利用基因组靶位基因的转录终止信号，得到有效表达，从而使靶细胞具G418抗性；非同源重 组的细胞中，因neo的转录障碍，不能有效产生G418抗性，由此实现同源重组转化细胞的富集筛选 图（l,B)o Joyne：等在鼠ES细胞En-2基因的定点突变中采用上述方法，同源重组与非同源重组比率为1:260(5)， 36 遗 传 HEREDITAS(Beijing)1999 21卷 比Thomas等 〔〕“在Hprt基因定点突变中的比率提高了4倍。Zijlstra等 ’〔〕“籍此方法获得高达1:25的同源重 组率，结合PCR筛选方法，得到热-m基因定点突变的细胞克隆，进一步的实验证实，该突变通过嵌合体生殖 性腺细胞转递给子代。