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细胞分子生物学研究方法概述 浙江大学医学院 丁世萍 分子生物学是在分子水平上研究生命现象本质和规律的科学。20世纪50年代DNA双 螺旋结构模型的发现，随后遗传信息传递“中心法则”的确立以及DNA重组技术的确立， 标志着分子生物学的蓬勃兴起，并且导致生物科学的面貌发生了根本性的变化。分子生 物学的兴起不仅揭开了细胞生物学上的许多难解之谜，而且其概念、方法和技术很快渗 透到生物科学的其他领域。分子生物学的每一次技术进步都可能带来一次生物学突破。 下面简要介绍几种应用较为广泛的分子生物学方法。 一、聚合酶链反应技术 聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR ），又称无细菌克隆技术(“free bacteria”cloning technique)，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。PCR 一改传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，操作简便，在数小时内可使几个拷贝的 模板序列甚至一个DNA分子扩增107 8 ~ 10倍，大大提高了DNA的得率。 PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于 1985 年发现和 研制成功的，因而荣获1993年度诺贝尔化学奖。PCR基本原理是：该技术为体外酶促合 成特异DNA片段的新方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循 环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而 后在低温（37~65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合， 形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷 酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链DNA模板，经过 一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行， 每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的 n 引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以 2 的指数形式迅速扩增，经过 25~30 6 7 个循环后，一般情况下可使基因扩增达10 ~ 10倍，将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染 色，在紫外灯的照射下（254nm）一般都可见到DNA的特异扩增区带。 随着实验研究的需要，又发展了多种PCR技术，巢式引物（nested primer ）PCR、多 重PCR（multiplex PCR ）、反向PCR（inverse PCR 或 reverse PCR ）、不对称PCR（asymmetric PCR ）、标记PCR（LP-PCR ）和彩色 PCR、加端 PCR、锚定 PCR 或固定 PCR、玻片 PCR、 反转录PCR（RT-PCR）方法检测RNA，定量PCR等。 PCR 技术不仅具有灵敏度高、特异性强、对原始材料质量要求低等优点，而且操作 简便，故广泛应用于医学生物学及其相关学科。目前，PCR 技术已应用于遗传病的产前 诊断、致病病原体的检测、癌基因的检测和诊断、DNA 指纹、个体识别、亲子关系鉴别 及法医物证、动、植物检测和高科技生物医学领域中。 二、原位分子杂交 原位核酸分子杂交技术简称原位杂交（in situ hybridization ，ISH ），是应用已知碱基 序列并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异 性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织 化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜下观察细胞内定位。这 一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质和多肽的相应mRNA的定位提供了手段， 为从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具，可视为组织化学 或免疫细胞化学中革命性的突破。 原位杂交技术的基本