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综合性实验：传代细胞培养及其增殖动力学检测 . 实验目的要求： 了解动物细胞培养的基本操作过程 学习传代细胞的传代方法 观察体外培养细胞在不同时期的形态变化及生长状况。 肝癌细胞HepG-2 肝癌细胞HepG-2的传代培养 1）将长满细胞的培养皿中原来的培养液弃去；加入新鲜的无血清培养液轻轻冲洗细胞。 2）加入1ml0.25%胰蛋白酶溶液，使瓶皿内的细胞都浸入溶液中；瓶口拧紧，放置在倒致显微镜下观察细胞，至消化结束时，加入1ml培养液终止。 3）1000rpm离心5min，弃上清，取沉淀。重复洗涤细胞一次。 4）用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分至2个平皿中继续培养。 有丝分裂指数的测定（了解） 1）取出细胞，制备细胞悬液。 2）加入苯酚品红染色3min，盖上临时盖片观察。 3）显微镜下计数100个细胞和其中的分裂细胞数。 4）按照公式计算有丝分裂指数。 MTT法测定细胞增殖 噻唑蓝染色光吸收实验法是近年来在国内外广泛用于分析药物对细胞作用的方法，但其裂解产物为难溶结晶体，测定步骤较多，容易吸出细胞，结果不稳定，敏感性相对较低。另外mtt反应这一步，至少需要3小时，不适合于观察某种药物的急性作用。????? MTT法测定细胞增殖 （1）以细胞培养液系列稀释细胞，浓度至5×104个/ml ，细胞贴壁培养6-24小时。 （2）在合适条件下加入药物白藜芦醇处理6至48小时。 （3）加入20μlMTT试剂后，培养板重新置于培养箱中，温育2-4小时。 （4）每隔一定时间，取板，在倒置显微镜下观察细胞内是否出现紫色点状沉淀。 MTT法测定细胞增殖 （5）当紫色点状沉淀在显微镜下清晰可见时，包括空白对照孔在内的所有孔内加入洗涤剂，每孔100μl。 （6）于酶标仪490nm下检测各孔吸收值。可选择550至600nm之间的任一波长检测吸收值。参考波长应高于650nm。空白对照孔的吸收值应接近于0。 （7）若读数过低，需将板继续避光温育。 （8）计算4个平行的平均值，减去空白对照孔的平均值后即得到个浓度细胞的光吸收值。 （9）对比实验组和阴性对照组，进行结果分析。 实验结果与分析讨论 Excel作图处理实验数据(样本) 实验总结与分析讨论 实验数据处理样本 实验数据处理样本 * * 阴性对照 浓度1 浓度2 浓度3 浓度4 阳性对照 ? ? ? ? ? ? 阴性对照 浓度1 浓度2 浓度3 浓度4 阳性对照 ? ? ? ? ? ? 阴性对照 浓度1 浓度2 浓度3 浓度4 阳性对照 ? ? ? ? ? ? 阴性对照 浓度1 浓度2 浓度3 浓度4 阳性对照 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? *