小麦及其近缘种WFL基因的克隆及序列分析.pdfVIP

小麦及其近缘种 WFL 基因的克隆及序列分析 杨建涛 指导教师：宋卫宁 摘要 以小麦及其近缘种为材料，对 WFL 基因进行了克隆和多序列比对，构建了系统进化树。 结果表明所得的几个序列与 GeneBank 中已知序列的同源性至少在 95%以上，多序列比对结果显示 克隆得到的序列之间的相似性很高，WFL  基因的突变符合中性突变，在小麦及其近缘种之间  LFY/FLO 同源基因的保守性很高，根据已知序列构建的系统进化树与我们 目前所认知的小麦亲缘关 系一致。 关键词 小麦及其近缘种；WFL 基因；克隆；序列分析  LFY 基因在植物成花过程中有着十分重要的作用。首先，它能协同其他成花相关基因抑制分生 组织的营养性发育。LFY 基因更关键的作用是参与花分生组织形成，正常功能的保持到防止花分生 组织逆转的整个过程。它参与促进花分生组织的形成和花分生组织属性的控制，维持花分生组织的 正常功能、花启动、防止花分生组织的逆转等。除此之外，LFY 基因还参与活化花器官属性基因， 以及花分生组织属性的决定，花分生组织的进一步发育等方面。LFY 基因在成花中的作用并不局限 于调控开花时间和花转变，而是在花序和花发育的各个阶段中都起着作用。LFY 基因与数十种的开 花时间调控相关基因间存在相互作用， 构成了一个基因调控网络。 而 LFY 在小麦中的同源基因 WFL  [1]  与小麦小穗发育有关，进一步的研究表明  WFL 基因在内稃的发育过程中起着重要作用  。植物中  LFY  同源基因的研究在分子进化领域具有重要意义。进行 WFL 基因的研究有利于弄清小麦成穗甚 至种子形成的分子机理，以及为小麦起源及驯化过程提供更多的证据。 1 材料与方法 1.1 材料  1)  普通小麦材料：Chinese Spring  晋麦 47  野生二粒小麦材料：Mt Hemon96  硬粒小麦材料：Coerulescens AC03  粗山羊草材料：2­4  2)  转化受体菌株为 DH5α,克隆载体为 pMD18-T Simple Vector(TaKaRa 公司)。  TM  3)  试剂 CTAB提取液，T aKaRa Taq  酶, TAE 电泳缓冲液， 琼脂糖 （Gene Tech公司），6×Loading  Buffer, DL2000 DNA Marker,DMSO(二甲基亚砜)，安徽优晶生物工程有限公司 H.Q..Q.凝胶回收试 剂盒Ⅱ，安徽优晶生物工程有限公司质粒小量提取试剂盒，其余试剂均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 小麦及其近缘种总 DNA 的提取  2007 年 3 月 10 日在农学院标本区利用冰盒速冻取样， 液氮破碎研磨，使用改良 CTAB 法提取供试材料总 DNA 并借助 0.8%琼脂糖凝胶电泳和 ND­1000 核 酸蛋白检测仪对总 DNA进行检测。 1.2.2 引物设计及 PCR 扩增 以 Genebank 中已知 WFLb  cDNA 序列(登陆号：AB231889)设计  PCR 特异引物 P1: 5’ CGTCTCGTGTCGTGCATGGAT 3’  P2: 5’ ACTGCACCTGGAGCAGGAAGA  3’ 。以以普通小麦材料 Chinese Spring、晋麦 47，野生二粒小麦材料 Mt Hemon96，硬粒小麦材料：  Coerulescens AC03 和粗山羊草材料 2­4 的总 DNA 为模板，以 P1 和 P2 为引物进行 PCR 扩增，反应 体系为 20µl,  反应程序为 94℃ 2min，94℃ 45s、64℃ 45s、72℃ 90s,35 个循环，72℃ 10min，4 ℃ forever。 1.2.3 PCR 产物的回收、连接及转化 目的基因 DNA 片段从琼脂糖凝胶上的回收使用安徽优晶 生物工程有限公司 H.Q..Q.凝胶回收试剂盒Ⅱ回收，操作按照试剂盒说明书进行。采用 TaKaRa 公 司的 pMD18­T Simple Vector 与目的片段进行连接，DH5α菌株为受体细胞进行转化。 1.2.4 重组质粒的筛选和鉴定 用