抗癌药长春碱合成前体文多灵的叶绿体定位合成.pdfVIP

抗癌药长春碱合成前体文多灵的叶绿体定位合成 向蓓蓓，朱晔荣，白艳玲，王勇” (天津市南开大学生命科学学院，天津，300071) 【摘要】长春花中双吲哚生物碱长春碱和长春新碱是重要的抗肿瘤药物，而单吲哚生物碱文多灵则 是合成它们的重要前体之一，因此通过遗传转化，提高细胞或植物组织中文多灵的含量，将为抗肿 瘤药物的体外合成提供优质原料，具有重要的应用价值．本研究将豌豆Rubi$C0小亚基的叶绿体定 位信号肽编码序列和文多灵合成关键酶编码基因粥和dat相连，构建了在叶绿体中定位表达这两 种关键酶的表达载体，并对长春花叶片进行了遗传转化，得到了大量的抗性愈伤组织．分子检测工 作正在进行当中，期望尽快得到转基因细胞系，将丈多灵积累在叶绿体中，为大量合成双吲哚生物 碱长春碱和长春新碱奠定基础． 【关键词】文多灵RT-PCR叶绿体定位表达裁体构建遗传转化 长春花为夹竹桃科多年生草本植物，是一种名贵的药材。长春花细胞内含有多种吲哚生物碱， 其中多数具有生物活性，如文多灵、长春质碱、蛇根碱、长春碱、长春新碱等，其中长春碱和长春 新碱是目前应用最广泛的天然植物抗肿瘤药物，可用于治疗何杰金氏病、恶性淋巴肿瘤、急性白血 病、绒毛上皮细胞癌等疾病，其硫酸盐已广泛应用于临床；阿玛碱可用于治疗高血压、心率不齐等 疾病；蛇根碱为镇痛药；而长春质碱则具有抗菌止血、利尿、降血糖等作用，而且它还是抗癌药物 长春碱、长春新碱等的合成前体Ill。 目前，人们主要从天然植物中提取长春花药用成分，但因含量仅为百万分之几至十万分之几， 所以产率很低，成本很高。因此，像长春碱和长春新碱远远满足不了临床上的需要。为了更有效地 生产长春花生物碱，科学家们曾进行了大量的相关研究。目前普遍认为，利用细胞培养技术结合遗 传转化，可能是提高生物碱产量的有效途径。 与常规栽培相比，细胞培养具有许多优点，它不受地区、季节、土壤及有害生物影响；细胞生 长和代谢过程的合理调节有助于降低成本和提高生产率；有利于细胞筛选、生物转化、寻找新的药 用有效成分；个体差异小，实验周期短，设备简单，便于研究并能节省入力、物力等等。 目前，长春花代谢途径的研究已有了相当大的进展，代谢途径上的大多数酶及其编码基因也得 到分离和鉴定(图1)IZl。 图l长春花中药用吲哚生物碱的代谢途径 ’2国家自然科学基金(项目编资助 由于通过基因工程可以实现目的基因在转基因植物中的大量表达，也可以改造一个代谢途径， 因此近年来在长春花的代谢途径关键基因的遗传转化方面已有一些研究报道。例如，Canei等人首 先用根癌农杆菌遗传转化的方法在长春花悬浮细胞中过表达tdc和stl％结果表明，过表达Str基 因的细胞系中蛇根碱、阿玛碱、长春质碱、它波宁的含量均得到了提高【引。 D4H和DAT是合成文多灵的关键酶，而文多灵是合成长春碱和长春新碱的重要前体。因此，文 多灵含量的提高不仅对长春碱和长春新碱含量的提高具有重要意义，而且对于体外半合成也意义重 物碱的积累H1，表明在毛状根中只是过表达dat基因无法提高文多灵的含量。 本文选用豌豆柏西叶绿体导肽(CTP)将目的基因d4h和dat的产物定位于叶绿体，使它们在 叶绿体中进行催化作用，将脱乙酰氧文多灵通过两步反应转化为文多灵，并积累在叶绿体中。 I．实验材料与试剂 I．I植物材料 长春花(Catharanthusroseus)种子：太平洋系列，购自浙江虹越花卉有限公司。 1．2菌种和质粒 转化用EscherichiacoliDH5口，侵染用根癌土壤农杆菌(Agrobacterium 由本实验室保存；携带豌豆cTP编码序列的通用中间载体TP—PSK由本实验室构建并保存；亚克隆用 T T载体pMD-19simple SK(+) (pSK)、植物双元表达载体pCAMBIM301和pGN由本实验室保存。 l-3酶与主要试剂 各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、RNase、Taqplus 试剂盒等购自TaKaRa生物(大连)有限公司；测序、引物及CTAB等生化试剂购自上海生工生物工程 有限公司。 2．实验结果 2．1长春花d4h基因和dat基因编码序列的克隆 AF053307)。利用Primer 和／stI的P1、P2，设计dat