Tet-off系统调控人IFN-γ基因在小鼠骨髓基质细胞中与表达.pdf

硕士论文；Tot-off系统调控人IF]q．T基冈在小鼠骨髓基质细胞中的表达 中文摘要 Tet．off系统调控人IFN-7基因在小鼠 骨髓基质细胞中的表达 摘要 1．研究背景 得血液学完全缓解、10％-26％获得主要细胞遗传学缓解。IFN—Y在多种实体瘤及 某些血液肿瘤的临床试验中治疗效果令人失望；但对慢性粒细胞白血病有肯定的 疗效。体外IFN—Y能显著地抑制CML骨髓来源的Ph+原始干(祖)细胞增殖，为 Ph一造血祖细胞腾出生长的空间”；l临床试验中，IFN-Y也能使部分CML患者获 得完全血液学缓解及细胞遗传学改善”。 临床上，IFN治疗CML需长期维持治疗，治疗非常不方便；我们实验室既 往开展了重组腺病毒IFN-Y基因修饰的骨髓基质细胞抗慢性粒细胞白血病的研 究，体外实验及动物实验均获得了良好效果。证实了IFN-7基因可借助于骨髓基 质细胞载体的归巢特性和靶向作用，在造血组织和肿瘤组织中持续表达，发挥抗 慢性粒细胞白血病作用。 过量的IFN—Y在抗CML同时能明显抑制和损伤正常造血干细胞，而且基因 修饰的骨髓基质细胞在骨髓中原位产生的IFN吖比外源注射IFN-T所致骨髓毒性 u／mi u／ml或每周1000u／ml外源 中，发现内源产生20 IFN-T就有相似于隔天200 IFN-3,的抑制长期培养起始细胞(10ng-termculture-initiatingcells，LTC—IC)生长和 抑制集落(CFU．GM或BFU．E)形成的作用。因而我们既往开展的这种抗白血病基 因治疗可能导致大量IFN—Y在骨髓原位产生，而导致严重的骨髓抑制，需建立 硕士论文：Te卜ofr系统调控人IFN-T-基因在小鼠骨髓基质细胞中的表达 中文摘要 调控式表达才能试用于临床。 Tet-off系统具有高效、特异、低毒和能严密开关目的基因的特点，在体内也 具有良好的调控基因表达效果，该系统并不存在于天然的真核细胞中，可能适合 于用来调控人IFN．Y基因在骨髓基质细胞中的表达。 初步探讨Tet-off系统介导的人IFN—Y基因在小鼠骨髓基质细胞中可调控式表达； 达到防治基因治疗中IFN．Y的骨髓毒性的目的。 2．实验方法 2．1 pTre-lFN-7的构建和鉴定 和目的基因，14连接酶连接酶切产物获得重组体pTre-IFN-7。双酶切和测序鉴 定重组体。 2．2小鼠骨髓基质细胞的分离和培养 mM 胎牛血清，2 L．谷氨酰胺，100units／ml青霉素，100 I．tg／ml链霉素)重悬细胞， 按Ixl06细IY皿／em2密度接种于25cnl2组织培养瓶中，置于37℃、5％C02细胞培 养箱中培养，每天倒置显微镜下观察细胞生长情况，培养3~4天后，全量换液去 除悬浮细胞，贴壁细胞继续培养，每3天半量换液1次。约12．18天左右培养至 下观察，待细胞变为短梭形、类圆形，大多从壁上脱落时中止消化。重悬细胞， U 硕士论文：Tet*off系统调控人IFN．T基因在小鼠骨髓基质细胞中的表达 中文摘要 接种浓度为2x105／ml，将获得的2～3代骨髓基质细胞用于下一步实验。 23脂质体介导pTet-off与pTre-IFN-T共转染 鼠骨髓基质细胞及检测IFN．．T表达规律 取2x106个对数生长期小鼠骨髓基质细胞接种于75cm2的培养瓶中，24h贴 壁后用PBS液洗涤两遍，加5IIll无血清LG--DMEM培养液；用250lIl无菌 生理盐水稀释24 lJ It min，加入 l无菌生理盐水中，混合HifectinII和质粒，室温放置15 g溶于250