免疫原-HPV16L1表达产物的制备与抗肿瘤活性的研究.pdfVIP

免疫原一[口V16LI表达产物的制备及抗肿瘤活性的研究24l 免疫原一HPVl6L1表达产物的制备及抗肿瘤活性的研究 宋国兴王立良许雪梅陈莲风刘世德司静姑李昆 人乳头瘤病毒(hmm 相关的高危型I-WV，如HPVl6，18等。 子宫颈鳞状上皮细胞癌(简称宫颈癌)是一种严重危害广大妇女特别是广大发展中国家妇 女身体健康的恶性肿瘤。本组大量分子流行病学及HPV基因转化实验研究证明：我国妇女的 宫颈癌与HPVl6密切相关，中国妇女的宫颈癌组织中，HPVl6基因的阳性率达84．6％…。 预防性疫苗，防止HPVl6的感染及其进一步引起的恶变，有重要的现实意义。 HPV难以通过体外组织培养或感染动物而得以繁殖，利用基因工程手段分离或体外重组 有效的保护性抗原，制成蛋白亚单位疫苗或基因工程疫苗为可能。通过基因工程技术构建含 HPVs不同基因的表达载体，从而获得基因表达产物，是HPV疫苗研究的重要方式。 我们选择真核表达体系——杆状病毒表达系统作为我们的研究HPVl6LI的表达体系。 以使其表达产物u可正确折叠、形成正确的二硫键，进而组装成类似天然病毒外壳的ⅥP。 并对HPVl6L1蛋白的生物学功能进行研究，探讨HPVl6疫苗的可能性。 材料与方法 (一)菌种。细胞和质粒 杆状病毒转移载体，pFasthac，菌种DHl0B 细胞系，菌株Ⅲ)5a为本室保存，重组质粒pBSSK—B．16L1为本室构建。 (二J抗体与试剂 鼠抗HPVl6L1单克隆抗体CamVir一1由英国剑桥大学张卫博士惠赠，XW—L1抗体由日 本国立传染病研究所KandaT教授提供。BarnH1，B础lI，EcoRI购于协和医科大学基础所开发 基，Lipofoctin购于Gibco公司。 引物设计：L1一对引物，上游引物(P1)：5 一3’；下游引物(P2)：5 B一Ⅱ酶切位点。测序引物：T3，T7由美国syb唧生物工程公司合成。 (三)实验动物 6—8周的BALB／c雌性小鼠购于中国医学科学院动物研究所。 作者单位：100005北京，中国医学科学院基础医学研究所生物物理系 242 中国癌症研究进展@ f四)聚合蔚联反应fPcR) 基因。 (五)重组杆状病毒的组建 L1 化DHl0Bac，冰浴30mill。42℃热休克90s，冰浴2rain。加入900mSOC培养基混匀，以 150 r／rain于37℃摇4～6h。用蓝白斑表型筛选阳性重组bac／B一16LI。在含卡那霉素、四环 素、庆大霉素的加培养基37℃培养20。24h，提取bac／B一16L1进一步鉴定阳性重组体。 f六)重组杆状病毒在舯细胞中的表达 在35 mm培养皿中分种9×10”Sf9细胞，每乎皿含2mlGRACE培养液研℃培养，用脂质 h后收集细胞和上清。 体方法将bae／B一16L1和bac／pFasthtwl分别转染s丹细胞，72 (七)SBS—PAGE及Western印迹杂交 200r／ 搜集的细胞加入1×SDS凝胶上样缓冲液，100℃煮沸5面，室温下离心1min(1 胶经电转膜转于硝酸纤维素膜上，进行酶联免疫反应实验。 (八)U蛋白表达水平的鉴定 白密度。 (九)电镜观察 0000 搜集感染72h的s19细胞各107。1 g离心10rain，弃上清，按电镜标本制备常规进 行标本处理，经超薄切片醋酸双氧铀染色，在JEMⅢ型电镜下观察。 (十)动物免疫 L1一、r【P于0．5mlPBS中加完全佐剂0．5 印m ml乳化，每只小鼠经皮下免疫5腭Ⅵ只 分别于免疫后14d和28d以同一剂量进行二次加强免疫，最后一次免疫的第14d处死小鼠， 心脏取血，搜集HPVl6L1一v