生物分离与纯化技术 教学课件 作者 邱玉华 主编 第三章.ppt

尚辅网 尚辅网 第3章 固相析出分离技术 第1节盐析法 学习目标 1．掌握盐析法的原理、特点及其影响因素。 2．掌握盐析法的具体操作方法及其注意事项。 3．能够熟练地进行盐析操作。 第1节盐析法 一、基本原理 二、盐析常用的盐类及其选择 三、影响盐析的因素 四、盐析操作过程及其注意事项 一、基本原理 在高浓度中性盐存在的情况下，蛋白质等生物大分子在水溶液中的溶解度降低并沉淀析出的现象称为盐析。盐析沉淀法简称盐析法。蛋白质，多肽、多糖和核酸等生物大分子都可以用盐析法进行分离。例如：20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀；43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀。但盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，其突出优点是：成本低、不需特殊设备、操作简单、安全、应用范围广、对许多生物活性物质具有稳定作用。但盐析法分离的分辨率不高，一般用于生物分离纯化的初步纯化阶段。 二、盐析常用的盐类及其选择 盐析所用无机盐的挑选原则主要有以下几点：①要有较强的盐析效果。一般来说，阴离子影响盐析的效果比阳离子显著，且含高价阴离子的盐比含低价阴离子的盐盐析效果好。②要有足够大的溶解度，且溶解度受温度的影响尽可能地小。这样便于获得高浓度的盐溶液，尤其是在较低的温度下操作时，不至于造成盐结晶析出，影响盐析效果。③不影响蛋白质等生物大分子的活性。并且，最好不引入给分离或测定带来麻烦的杂质。④来源丰富，价格低廉。 二、盐析常用的盐类及其选择 盐析常用的盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、磷酸二氢钠等。实际应用中以硫酸铵最为常用，主要是因为硫酸铵有以下优点：①离子强度大，盐析能力强。②溶解度大且受温度的影响小。尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其它盐类所不具备的。由表3-1可以看出，硫酸铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类。③有稳定蛋白质结构的作用，不易使蛋白质变性。有的蛋白质在2～3mol/L的(NH4)2SO4溶液中可保存数年。④价格低廉，废液不污染环境。缺点是硫酸铵水解后变酸，在高pH下会释放出氨，腐蚀性较强。因此，盐析后要将硫酸铵从产品中除去。 三、影响盐析的因素 1．盐饱和度的影响 2．样品浓度的影响 3．pH的影响 4．温度的影响 1．盐饱和度的影响 由于不同的生物大分子其结构和性质不同，盐析时所需要的盐饱和度也不相同。因此在实际应用时，应根据具体的工艺要求，通过实验确定所需的盐饱和度。另外，可以通过调节盐饱和度，使混合溶液中的各种蛋白质组分分段析出。 2．样品浓度的影响 在相同的盐析条件下，样品的浓度越大，越容易沉淀，所需的盐饱和度也越低。但样品的浓度越高，杂质的共沉作用也越强，从而使分辨率降低；相反，样品浓度小时，共沉作用小、分辨率高，但盐析所需的盐饱和度大，用盐量大，样品的回收率低。所以在盐析时，要根据实际条件选择适当的样品浓度。一般较适当的样品浓度是2.5％～3.0％。 3．pH的影响 一般地说，两性生化物质在等电点pI附近溶解度最低，最容易沉淀析出。但是有些生化物质在等电点附近不太稳定，因此，盐析的pH值，应该在保证待沉淀物稳定的前提下，尽可能地接近其等电点。另外，由于不同的生化物质具有不同的等电点，将溶液的pH调至目的物的等电点可以减少共沉作用。 4．温度的影响 一般地说，在低盐浓度或纯水中，蛋白质等生化物质的溶解度随温度降低而减小。但对多数生化物质而言，在高盐浓度下，它们的溶解度随温度的降低反而增大。另外，高温容易导致某些生化物质变性。因此，盐析一般在室温下进行。但对于温度敏感型的生化物质，盐析最好在低温(0～4℃)下操作，以免丧失活力。 四、盐析操作过程及其注意事项 1．盐析曲线的制作 2．操作方式 3．脱盐 4．操作注意事项 1．盐析曲线的制作 取已定量测定蛋白质(或酶)的活性与浓度的待分离样品溶液，冷却至0℃，调至该蛋白质稳定的pH值，分6～10次分别加入不同量的硫酸铵，第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点。继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到6～10个级分，按照每次加入硫酸铵的量，在表3-2中查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线。 2．操作方式 (1) 加硫酸铵的饱和溶液 (2) 直接加固体硫酸铵 (1) 加硫酸铵的饱和溶液 在实验室和小规模生产中溶液体积不大时，或硫酸铵浓度不需太高时，可采用这种方式。这种方式可防止溶液局部过浓，但是溶液会被稀释，不利于下一步的分离纯化。 为达到一定的饱和度，所需要加入的饱和硫酸铵