采用2D电泳初步进行牛精子蛋白分离研究.pdfVIP

Animal BuUe虹u 363 Bioi№chnology 采用21)电泳初步进行牛精子蛋白分离研究+ 王栋1，沙里金12，朱化彬卜，程金华1，王振玲13，郝海生1，杜卫华1，张营霞1 00094 30000 (1．中国农业科学院畜牧研究所，北京1 2．吉林农业大学动物科技学院，长春市1 3内蒙古农业大学动物科学与医学学院， 呼和浩特010018) 摘要：为了建立牛精子蛋白的分离技术路线，对牛精子细胞裂解方法、双向电泳条件等 进行了摸索，结果发现采用尿素一盐酸胍两步裂解法裂解精子细胞制备蛋白，并使用13Cm非线性 胶条进行蛋白二维电泳，能取得较好的实验结果。图谱经二维电浠软件分析，可检测出约800 多个蛋白质点．对精子蛋白双向电泳条件的摸索，为后续牛精子特畀眭蛋白的检测和分析奠定 了基础． 。 关键词：牛；精子：双向电泳 作为高等生物父系遗传物质的传递载体，精子基因的表达是精子正常发育的前提，也是其运动、获 能、与卵子结合并诱导胚胎正常发育和进行正常性别分化的根本保证。对精子蛋白质的研究，有助于通 过精子本身了解受精过程的分子机理，对治疗不育和进行生育调控均有重要意义。所以许多学者从不同 角度对精子的生育相关蛋白进行了研究，如对透明带结合蛋白(张蕴斌等，2003；苟克勉等，1999；夏欣 一等，2002)、对获能相关蛋白(FicarroS等，2003)、对精子运动相关蛋白(宛传丹等，2005)、对顶体反 应相关蛋白(张玲等，2004)等的研究。但越来越多的研究表明，生命调控是一个有机的整体，针对单 个蛋白进行研究的方式已无法满足我们对生命现象全面深刻的理解，从整体蛋白质水平研究某些蛋白质 的功能，比较不同生理或病理条件下及不同处理条件下蛋白表达的异同，并对相关蛋白进行分类和鉴定， 可望能深刻地揭示生命的本质，并为人类提供进行生命干预的方}去(毕焕洲等，2005；夏其昌等，2004)。 本研究以牛精子为实验材料，通过精子细胞的裂解、蛋白抽提、双向电泳分离、凝胶染色等实验过程的 探索，力图建立起牛精子蛋白的全蛋白组分析方法，为进一步对精子中性别相关蛋白、生殖相关蛋白的 质谱鉴定及功能分析奠定实验基础。 1材料和方法 1．1试剂与设备 2DClean NLImmobilineTM Kit，llcm和13cm up 化学研究所监制；银染试剂均购自国内。 超纯水系统(美国)。 1．2方法 1．2．1精液标本及洗涤 精液来自本室饲养的健康、有生殖能力的皮埃蒙特种公牛冷冻精液。从液氮罐取出细管冻精，40℃ +基金项目：国家高技术试验发展专项经费(课题号：2004AA243011)及中国农科院畜牧所所长基金资助。 第十次全国畜禽遗传标记研讨会论文集 Tris)溶液重悬沉淀，50009离 水浴解冻，60009静山5min，去上层精浆。用0．25M蔗糖(含5mmol／L 心lOmin，重复洗涤3次。 1．2．2精子细胞裂解方法的比较 尿素裂解液(TM尿素、2M硫脲、4％CHAPS、lOOmM 取500ul盐酸胍裂解液(5M盐酸胍、0．28M2-巯基乙醇、O．5MTris)裂解1支细管冻精，漩涡振荡2min， 镜下观察：④尿素．盐酸胍两步裂解法：取300ul尿素裂解液(同方法①)裂解1支细管冻精，漩涡振荡 DTr、40raMTris，4mM 胍、lOOmM EDTA)，漩涡振荡2min，镜下观察。 1．2．3不同蛋白制备方法的二维电泳比较： 从裂解细胞方法中选取裂解效果较好的③和④制备精子蛋白，进行后续的二维电泳实验研究。 1．2．3．1精子蛋白制备 1．2．3．1．1盐酸胍一步裂解法