人源ARL5-GDP3P复合物在2.0A分辨率下的结构研究RACK1的表达纯化和晶体摸索工作.pdfVIP

摘要 人类基因组计划的顺利实现，促进了结构基因组计划的实施。结构基因组旨在 测定足够多的蛋白质的三维结构，这样使得所有的蛋白分子都可以通过同源建模的 方法预测其三维结构。近几年结构基因组的工作取得了一定的成果，这种基于高通 a方法为主要手段的结构基因组计划势必对结构生物学的发展起着强有力的推动作 用。我们实验室也参与到了国内的结构基因组项目中，我们选择的靶基因是造血干 细胞中的新基因。 人源ARL5是ARL家族的一员，它在真核生物中广泛存在，种间保守，但是对 I=它们的三维结构特征和具体生理功能尚未有报导。我们表达纯化并解析了ARL5 与GDP3P复合物在2.以分辨率下的结构口人RL5具有ARF家族的典型结构特征， 同时它还具有其独特的地方。细菌表达的ARL5天然地结合了菌体自身的GDP3Po 其N末端的肉豆范酞化位点Gly被结晶时所添加的detergent试剂TritonX-305 的疏水尾巴所环绕，模拟了天然肉豆范酞化的状态。其整个分子的结构特征以及其 核昔酸结合部位的两个关键motif的序列和结构特征表明ARL5也同其他的ARF分子 一样，具有典型的GDP/GTP循环，在生命活动中起着很基础的作用。 多对同晶置换法是解析蛋白质晶体相位的传统方法。通过对KD93的进行重原 子的浸泡实验，我们得到了一种重原子衍生物，由于衍生物与母体不同晶所以没有 用于计算，不过结构用MA1〕方法解析之后我们可以清晰的找到重原子的结合位点， 这也启示我们对于不同晶的重原子衍生物，可以尝试用反常散射信号来解析相位。 RACK1是一个骨架蛋白，它可以与许多信号分子发生作用。它主要通过调控 的方式与蛋白激酶和膜结合受体发生作用。最近又有实验表明它是真核核糖体的组 成部分。通过对RACKI基因的分子生物学改造，我们得到了含有N端融合蛋白和 C端融合蛋白的表达产物，并分别长出了微晶。不过晶体的优化陷入了困难。于是 我们又针对性的对其进行了点突变的工作。己经拿到了突变的载体，工作还在进行 叫J。 Abstract TheaccomplishmentofHumanGenomeProjectbooststheimplementationof StructuralGenomicProject.TheStructuralGenomicProjectaimstosolveenough structures,sothatalltheproteinsturcturescanbepreciselypredictedbyhomologous modelingmethod.Uptonow,theStructuralGenomicProjecthasacquiredsomeprogress. Thishighthroughput-methodbasedprojectwillinevitablyacceleratetheprogressof structuralbiology.OurlaboratoryparticipatesintheStructuralGenornicProjectinChina, ourtargetsarenewgenesrfomhumanhaematopoieticstemcells. HumanARL5isamemberofARLs,whichiswidespreadinhigheukaryotes,and homologousbetweenspecies.Butnosturctureorbiologicalfunctionofthismemberis reported.Weexpressed,purifiedandresolvedthestructureofhumanARL5withbound GDP3Pat2.0Aresolution.BesidesthetypicalfeaturesofARFs,humanARL5has specificfeaturesofitsown.BacteriallyexpressedhumanARL5containsboundGDP3P. ThehydrophobictailoftheinrtoduceddetergentTritonX-305bindsatthepossible myristoylationsiteofGlyz,simulatingthemyristoylatedstateofN-terminalamphipathi