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四环素人工抗原的合成与鉴定_临床医学论文 四环素人工抗原的合成与鉴定_临床医学论文 作者：肖理文, 袁耀萍, 郗日沫, 孙秀兰, 王洪新 【摘要】 　　目的: 对牛血清白蛋白进行羧基化和四环素的衍生化, 制备更高偶联比的四环素（TC）-牛血清白蛋白（BSA）偶联物并进行鉴定。方法: 四环素通过两步衍生化后, 形成一种活泼的重氮化中间产物, 与羧基化的BSA上的表位羧基反应, 合成TC-BSA偶联物。结果: HPLC-MASS图谱鉴定表明成功的制备了四环素衍生物, 红外及紫外扫描图谱表明, 偶联成功, 计算得偶联比分别为7∶1和11∶1。 结论: BSA经过羧基化后的偶联效果明显好于未经羧基化的BSA, 并成功制备了TC-BSA人工抗原。 【关键词】 四环素（TC） 羧基化 偶联 人工抗原 　　四环素类抗生素（TCs）是一类由链霉菌产生的宽谱抗生素, 对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均具有较强的抵抗能力。 因其高效、便宜且能直接通过口服起效的特性, 被广泛应运于禽畜养殖业中, 既能预防治疗疾病, 也能起促进生长的作用。 1998年, 欧洲动物卫生联盟的一份调查显示, 在欧盟15国中, 四环素类抗生素的使用量占了整个禽畜业中抗生素使用量的65％［1］。 在国内, 四环素类抗生素也同样被大量广泛的用于禽畜养殖业中。 人长期低剂量的摄入四环素类抗生素可能会产生各种慢性和蓄积性疾病, 主要表现在对胃、 肠、 肝脏的损害, 以及牙齿的染色, 还会造成过敏反应、 二重感染、 致畸胎等, 同时可能会导致人体肠道中菌群平衡的失调以及耐药性细菌的产生。 为此, 我国规定畜禽肉中四环素的最大残留量不得超过100 ppb, 禽蛋中不超过200 ppb［2］。 目前, 我国用于检测四环素类抗生素的ELISA试剂盒主要靠国外进口, 价格昂贵, 因此急需开发拥有自主知识产权的试剂盒或免疫传感器, 而其关键之一就是制备具有优良免疫原性的四环素完全抗原。 我们通过对载体蛋白BSA进行羧基化, 大大提高了其表面活性羧基的数量, 同时对四环素进行衍生化, 获得活泼的重氮化中间产物, 再与BSA及sBSA偶联, 制备四环素完全抗原并对其进行比较。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 UV-2100紫外扫描仪为北京瑞利公司产品; Nicolet Nexus傅立叶变换红外光谱仪为美国热电公司产品; WATERS Platform ZMD4000型高效液相色谱质谱联用仪为美国WATERS公司产品; 950 mL/L盐酸四环素标准品(TC.HCl)购于中国药品生物制品检定所; 牛血清白蛋白（BSA）为北京博奥生物技术有限公司Sigma公司进口分装; 丁二酸酐（Succinic anhydride）、 N-氯丁二酰亚胺(NCS)、 水合肼（Hydrazine hydrate）均为美国Sigma公司产品; 其他试剂均为分析纯; PBS缓冲液为0.01 mol/L, pH7.4, 所用水均为SZ-97自动三重纯水蒸馏器制得。 　　1.2 方法 　　1.2.1 BSA的羧基化(sBSA) 取20 mL 0.1 mol/L 的NaCl溶液, 用0.1 mol/L 的NaOH溶液调pH值至8.0, 冷却至4℃, 加入1 g BSA充分溶解后, 缓慢加入75 mg丁二酸酐, 用3.5 mol/L的NaOH调pH值至8.0, 保持4℃磁力搅拌1 h, 随后于PBS缓冲液中透析3 d, 及时换液, 最后冷冻干燥得粉末状固体, 于-20℃下保存备用［3,4］。　　1.2.2 TC半抗原的衍生化与鉴定 TC在酸碱条件下都比较活泼, 容易形成差向异构化四环素或降解［5］, 因此通过两步衍生化, 封闭其活性基团, 形成一种活泼的重氮化中间产物, 再与BSA偶联。(1)四环素衍生物4-氧代脱-甲氨基四环素4, 6-半缩酮（C20H17O9N）（TC1）的合成: 称取400 mg TC.HCl标准品, 溶解于20 mL超纯水中, 滴加适量0.01 mol/L的盐酸溶液, 使盐酸四环素充分溶解。 室温条件下, 加入280 mg NCS粉末,磁力搅拌数分钟后有沉淀析出。 反应30 min后, 过滤, 得粗产物, 加入5 mL超纯水洗涤, 然后加入10 mL乙醚萃取, 放掉下层水相, 反复操作3次, 以有效去除杂质。 最后将萃取液置于通风厨中, 自然挥发收集产物, 取少量进行HPLC-MASS鉴定［6］。 (2)四环素衍生物4-腙-脱甲基-四环素（C20H19O8N3）(TC2)的合成: 取220 mg上步反应所得的TC1溶于15 mL 950 mL/L的乙醇中, 室温下缓慢加入50 μL水合肼, 立刻析出沉淀, 磁力搅拌1 h。 过滤得粗产物, 加入8 mL乙醇洗涤, 反复3次, 收集产物, 取少量进行HP