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外周血单个核细胞分离方法探讨_临床医学论文 外周血单个核细胞分离方法探讨_临床医学论文 作者：韩亚萍刘源章莉莉刘婷李军黄祖瑚 \ 【关键词】 羟乙基淀粉 【摘要】 目的 探讨外周血单个核细胞（PBMC）的不同分离方法对分离效果、贴壁能力以及淋巴细胞的增殖活性的影响。方法 取肝素抗凝血，分别用羟乙基淀粉（hydrixyethylstarch，HES）自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll密度梯度离心法三种方法分离单个核细胞，直接进行贴壁计数及多种细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-induced killer，CIK）培养。结果 HES自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll密度梯度离心法分离的PBMC回收率分别为86.4%、86.0%、85.1%。结论 羟乙基淀粉离心沉淀法可有效地分离PBMC。 关键词 羟乙基淀粉 淋巴细胞分离液 单核细胞. 【Abstract】 Objective To investigate the difference among three protocols of isolating peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）through observing the recovery rate，the adherent ability and lymphocytes proliferation acˉtivity of the isolated PBMCs.Methods Use three different isolation protocols，HES（hydrixye thylstarch）sedimentation method，HES centrifugation method and Ficoll density gradient centrifugation，to isolate PBMCs from healthy donors.Then compare these isolation protocols through observing the recovery rate of PBMCs，the number of p lastic-adherent cells and the cytokine-induced killer cells proliferation.Results The recovery rate of PBMCs is86.4%by HES sedimentation method，83.7%by HES centrifugation and sedimentation method and85.1%by Ficoll density gradient centrifugation［method］ separately.Conclusion Our observation provide evidence that HEScentrifugation method could efficiently isolate PBMCs from human peripheral blood. Key words hetastarch ficoll monocyte 外周血单个核细胞分离效果直接影响细胞培养结果，经典的Ficoll密度梯度常用于少量血液分离，而在血液较多时则须分成许多离心管，重复地开放操作增加了污染机会。为此，我们用HES离心沉淀法代替Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，对不同方法获取PBMC的贴壁能力和CIK细胞增殖活性等作一较为系统的探讨。 1 材料和方法 1.1 材料 外周血:健康成人外周血10份。Ficoll:上海试剂二厂，分子量400000。6%HES:DUPONT公司生产，分子量480000。 1.2 方法 1.2.1 外周血单个核细胞的分离 HES自然沉降法 ［1］ :即肝素抗凝血与6%HES按5:1混合，自然沉降60min，取上层液400×g离心10min，以RPMI1640洗两遍备用。 HES离心沉淀法:分别将抗凝血与HES12:1、7:1、6:1、5:1、3:1、2:1，使HES终浓度为0.5%、0.85%、1.0%、1.2%、2.0%和3.0%条件下20℃60×g离心10min，取上层液400×g离心10min，以RPMI1640洗两次备用。 Ficoll密度梯度离心法 ［2］ :肝素抗凝血先与RPMI1640培养液1:1混合，再加等量淋巴细胞分离液600×g离心20min，小心吸取单个核细胞层，以RPMI1640洗两遍备用。 1.2.2 PBMC的处理 将不同分离方法获取的PBMC计数后重悬于完全培养基中，分别加入24孔培养板，每孔4×10 6 细胞，37℃，5%CO