芥菜植株原位真空渗入遗传转化技术地研究.pdfVIP

园艺学进展(第六辑) 芥菜植株原位真空渗入遗传转化技术的研究 金万梅h2巩振辉H吕元红 (-西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌712100，2北京市农林科学院林业果树研究所，北京100093) 摘要以蕾期的芥菜(Brassica胁c犯co鹞)生态型雪里蕻和圆叶芥为试材，在携带潮霉京 磷酸转移酶标记基因的根癌农杆菌(Agr6actzrlum“Ⅷt岛d∞s)菌株GV3101的介导下，对影响芥 菜植株原位真空渗入遗传转化效果的真空渗入时间、根癌农杆菌悬浮孢子的浓度、渗入培养基、感 染方式等进行研究。结果表明，真空渗入时间为2rain／间歇30s／30sl菌液浓度o‰为0．8l渗入培 养基为1／2Ms删+B5枞，菌株采用强感染型的，对花蕾进行真空渗入。可以获得最佳转化效果。 关键词植株原位真空渗入法}遗传转化}根癌农杆菌#芥菜 芥菜，是我国的一种重要加工和鲜食蔬菜。探索芥菜高效遗传转化体系对加速芥菜遗传 转化，提高芥菜的品质和产量具有重要的理论和实践意义。Bechtold等【1]在拟南芥的遗传转化 研究中，首创了植株原位真空渗入遗传转化方法。此后，许多学者在拟南芥口问和芸薹属一些作 物E钉上进行了尝试，但尚未对影响植株原位真空渗入遗传转化效果的因素进行系统研究。本实 验以芥菜为试材，对影响转化频率的真空渗入时间、根癌农杆菌悬浮孢子的浓度、渗入培养基、 感染方式以及根癌农杆菌菌株等多个参数进行研究，旨在建立和优化芥菜植株原位真空渗入 高效遗传转化技术，为芥菜乃至芸薹属作物遗传转化提供方法与技术。 1材料和方法 1．1植物材料 Coss)品种为叶用“雪里蕻”和根用“圆叶芥”均由河北邢台华丰 供试芥菜(岛u5s妇豇ncea 种子公司提供。芥菜种子经50x2温烫lOrain、23C浸种2～6h、催芽20h、置于0～4C低温下 处理25d，或露地9月下旬和次年2月下旬播种，易形成高度适宜、现蕾的健壮植株，以此期植 株作为处理材料[5]。 1．2影响芥菜植株原位真空渗入遗传转化的因素处理 根癌农杆菌菌株GV3101，其构建见参考文献[33，携带潮霉素磷酸转移酶基因。在真空渗 入前2d开始培养繁殖。挑取单菌落接种于400mL含LB培养基上，28‘C黑暗条件300r／ 000 min，振荡培养36h，达到对数生长期平台期，4 r／rain离心lOrninf收集农杆菌，用1／ 2MS无帆+B；有机钉渗入培养基稀释，分光光度计确定菌液浓度，放入抽真空的容器中。将植株倒 置，花蕾部位浸于渗入培养基中，此时抽成真空，然后恢复常压，植株花蕾出现伤口，农杆菌从 伤口部位侵入。进行了以下处理，每处理取材20株，重复3次。处理之后，取出植株，移栽至温 室用塑料薄膜覆盖，黑暗条件12h缓苗后，转入常规管理，待植株开花结籽，按各处理收获并 干燥种子，备用。 基金项目：国家自然科学基金项目}陕西省自然科学基金项目(2001SMll)}陕西省农业分子生物学重点 实验室基金资助项目。 作者简介：金万梅，女．硕士，助理研究员。 -通讯作者。Authorfor con_espondence．E-mail；gzhhl68@yahoo．tom,cn 蔬 菜 381 1．2．1真空渗入时间处理 rain／间歇30s／30s(抽真空1min后，立即 菌液浓度0196。。一o．8，真空处理时间分别为1 打开放气阀，恢复常压，30S，再抽真空30S，下同)；2min／间歇30min／30s；2mini间歇1．5 rain。 min／30s；2rain／间歇3min／30S；连续2min；连续3 1．2．2茵液浓度 S。 设0D。分别为0．4、0．8、1．2，真空渗入时间为2rain／间歇30s／30 1．2．3渗入培齐基 渗入培养基分别为水，1／2MS无机，1／2MS无机]DB5有机，和B