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·21· Western blot分析；纯化后的目的蛋白送北京华大蛋白质研发 中心进行质谱分析。 固粘附及血栓形成的先决条件。这使GPVI成为极具价值的 结 果 抗栓治疗新靶点。因此，目前对GPVI功能机制的研究逐渐 成为热点。 1．PCR扩增GPVI—ex2片段：经PCR扩增出461bp大小 的DNA片段，与预期相符。 然而，在生理状态下，GPVI与胶原纤维结合的作用机制 2．原核表达载体的构建及鉴定：阳性克隆经双酶切后， 还不十分清楚。根据GPVl分子结构推测，两个Ig-C环可能 释放出461bp和4．9kb大小片断。DNA测序证实插入片段 为胶原结合的部位。本研究中将GPVl分子的两个Ig-C环 正确。 分别在原核表达系统中表达，同时表达GPVl分子胞外区全 3．重组融合蛋白的诱导表达：SDS电泳结果显 长，旨在为研究GPVl分子结构特点，分析GPVl分子与胶原 示，在Mr42000左右出现明显表达的蛋白条带，与预期的融 的结合位点以及制备抗GPVI抗体获得纯化的蛋白。 合蛋白分子量相符。融合蛋白GPVI—ex2／GST主要以包涵体 遗憾地是，我们最终只得到了第二个片段的可溶性表达， 形式存在于沉淀中，上清液中表达量较低。 第一个片断仅在包涵体中表达，而全长片断则未表达。为了 4．诱导条件的优化：在30℃、0．1mrnol／LIPTG诱导3 便于纯化，我们在实验中选择了带有GST标签的表达载体 小时条件下目的蛋白表达量最高。 pGEX-3x，使后续工作变得简单。 5．重组融合蛋白的纯化及Western blot鉴定：超声裂解 纯化得到的融合蛋白将用于：1．观察融合蛋白是否能与 后的上清液纯化后，经10％SDPAGE电泳分析，目的蛋白 胶原纤维结合，阐明GPVl分子与胶原的结合位点；2．观察 呈单一条带；用抗GST抗体进行Western blot分析，显示为单 融合蛋白对胶原诱导的血小板聚集的影响，为研制抗血栓药 一条带。 物奠定基础；3．制备抗GPVl分子的单抗或多抗。目前，抗 6．融合蛋白的质谱分析结果：经质谱分析，GPVI—ex2／ GPVI抗体尚无商品化的单抗，这为迸一步研究GPVl分子的 GST融合蛋白得分221(68分有意义)，融合蛋白的分子质 结构和功能带来了不便，因此制备相应抗体迫在眉睫。这方 量为42kD，与预期一致。 面的工作我们正在进行中。 讨 论 目前的研究认为，GPVI介导血小板与胶原的初次粘附， PCT对发热性疾病诊断价值的探讨 王丽李娟杨忠礼赵素元 降钙素原(PcT)已被广泛应用于临床各科。现有资料证 2．P(YI检测采用快速免疫金标法：试剂为德国B．R．A． 明PC了可作为全身炎症反应的早期特异性诊断指标。在局 30min 部感染、病毒感染、慢性非特异性炎症、癌性发烧、移植物宿主 半定量检测。 排斥反应或自身免疫