外源褪黑素促进牛卵母细胞体外成熟地研究.pdfVIP

外源褪黑素促进牛卯母细胞体外成熟的研究 高 超 田秀芝 张璐 徐 静 汪 锋 卓志勇 戴蕴平刘 国 世 中国农业大学动物科技学院，北京100193 摘要：[目的]探索外源褪黑素(melatonin，MT)处理对牛卵母细胞体外成熟的影响从而优化牛体外胚胎生产的体 系。[方法]以屠宰场牛卵巢卵母细胞为材料，卵母细胞成熟过程中添加不同浓度的MT，观察统计体外受精后胚胎的 卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数。并应用放射免疫分析法检测血清、卵泡液和成熟培养液内MT与孕酮(P)、雌激素(E2)、 促卵泡素(FSH)、促黄体生成素(LH)水平的变化并检测卵母细胞的活力和活性氧(ROS)的浓度。[结果]牛卵泡液 中存在MT浓度与血清中相近，添加10-11mol.L-1MT组的P浓度2.01±0.33显著高于照组(P＜0.05)。与对照组相比， 10-9mol.L-1MT组卵裂率显著提高 （77.81±7.06％比vs67.32±7.30％,P＜0.05），并能提高囊胚率且囊胚细胞数显著高于 对照组 （90.30±28.74vs75.07±25.98,P＜0.05）；同时10-9mol.L-1MT组卵母细胞的活力高于对照组，并能降低卵母细 胞内的ROS含量但没有显著差异(P＞0.05)。[结论]牛卵泡液中存在MT，适当浓度的外源MT能促进牛卵母细胞 体外成熟。 关键词：褪黑素；卵母细胞：体外成熟；活性氧；牛 首届全国奶牛精细化管理高峰论坛暨奶牛精细化饲养关键技术与设施设备研讨会 胚胎移植(IVF．-ET)上的研究表明，ROS会降低卵母细胞的质量，MT可以保护卵母细胞免受自由基 的损伤，并且可以提高体外受精率【s】oShi等‘91研究表明，猪卵泡液存在MT，且在猪卵母细胞成熟液 中添加10一moi．L‘1MT可以显著提高猪卵母细胞的体外成熟率及孤雌激活后的囊胚发育率和囊胚细 MT可以明显降低Ros的含量，促进卵母 ng·mLd 胞数。Kang等【51在猪卵母细胞的IvM体系中添加10 细胞的核成熟和胞质成熟。与此同时Manjunatlla等(10】通过在水牛的成熟液中添加外源MT得出10 pm．L．1和50)am·L‘1的MT可以显著提高卵裂率，10pm．L-l组成熟的卵母细胞体外受精获得的可用胚胎 数量最多EI．Racy等[111发现牛卵细胞和颗粒细胞上存在MT受体并且此还发现添加lO和50ng·mL。的 褪黑可以素促进体外牛卵母细胞的核成熟。【本研究切入点】对于牛卵泡中MT浓度的研究，国内外 尚未见。MT对牛卵母细胞体外成熟的影响及作用机制尚不明确。因此希望通过对MT处,理对牛卵细 胞体外成熟的影响，揭示MT,促进卵母细胞成熟的机理，为优化牛卵母细胞体外成熟体系提供新思路。 【拟解决的关键问题】本研究通过在卵牛母细胞成熟过程中添加不同浓度的MT，观察统计体外受精 后胚胎的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数，从而揭示MT对牛卵母细胞体外成熟的影响。 2材料与方法 2．1试验时间及地点 本实验于2010年3月至2010年7月完成，实验地点为中国农业大学动物科技学院繁殖实验室。 2．2试验材料 牛卵巢来自河北省廊坊市大厂回族自治县屠宰场，牛血清采自该屠宰场屠杀的不同母牛，冷冻 精液购自北京奶牛中心。 Iodide、丙酮酸钠、肝素钠、咖啡因、必需氨基酸、 酸酶、无脂肪酸BSA、Hoechest33342、Propidium 非必需氨基酸、矿物油和其他无机盐类均购自sigma公司(st．Louis．，MO，USA)。 2．2．1成熟培养液 E2，lOO“g／mg M199培养液(GIBCO)中加入10％FBS，10“g／mLFSH，lgg／mLLH，lpg／mL 青霉素，100峙·mL-I链霉素。 2．2．2透明质酸酶 取透明质酸酶0．19，溶于10mLDPBS溶液中，0．22岬滤膜过滤灭菌，-20(2保存。 2．2．3Hoechst33342 IOmLDPBS溶液中溶解100mg 10mL，4℃备用。 215