流加变性溶菌酶方式的高浓度蛋白质复性的研究.pdfVIP

流加变性溶菌酶方式的高浓度蛋白质复性研究 高永贵 关怡新 姚菩注 (浙江大学化学工程与生物工程学系，杭州310027) 摘要 在探讨滚菌醉变性时DT『的用童及复性进程的特性基础上，研究了流加稀释复性以提高复性 收率，起始及终了蛋白质浓度。结果表明，变性液中DTT最适浓度为30mM,溶菌醉活性中心或附近 的一对二硫健的正确配对是复性的关健;复性液中添加合适的膝并采用流加变性溶菌醉方式能明显促 进正确的二硫健形成进而获得高的复性率，流加方式优于直接稀释复性，而三种流加方式 (2次、3 次和4次流加)的复性率无差异。 关健词 蛋白质复性 溶菌膝 二硫健 流加操作 1 引言 重组目的蛋白常以包涵体的形式在宿主细胞大肠杆菌中进行表达，由于包涵体无活性，必 须经过一系列操作才能获得生物活性，这些操作包括包涵体的分离、变性剂溶解及蛋白质复性。 包涵体蛋白复性是生物技术产业化的关键过程，必将成为后基因组计划的研究热点{}‘。随着变性 蛋白质浓度的增加，蛋白质的复性收率明显下降。然而，蛋白质在低浓度下复性不仅需要大量 的反应器和复性液，同时增加了活性蛋白的回收难度。虽然有不少复性方法[23〕可用于提高蛋白 质的浓度和复性收率，但采用流加变性溶菌酶方式并在复性液中添加合适的脉是一种有效且简 便易行的方法，这是因为变性蛋白质在低浓度下的逐渐再折叠累加成整个过程的高复性收率[[U 近年来变性溶菌酶常被作为模型蛋白用于评价新的复性技术，因此本文在探讨溶菌酶变性时DTT 的用量及复性进程的特性基础上，对流加操作方式的蛋白质复性方法进行了研究，期望促进在 高蛋自质浓度下获得高收率的蛋白质复性技术的发展。 2 材料和方法 2.1 材料 溶菌酶，底物微球菌，还原型和氧化m谷肤昔肤 (GSH,GSSG)，二硫苏糖醇 (DTI)均购 自Sigmao测定溶菌酶的自由一SH数时，用预装凝胶柱 (HiTmpDesalting,AmetshamPhamacia Biotech)脱去溶液中的DTT和GSH。其它试剂为国产分析纯。 2.2 变性溶菌醉的制备 40mg/ml的天然溶菌酶用含8M脉及一定浓度DTT的0.1MTris一HCI,pH8.5的缓冲液于室 温下变性4h即得变性溶菌酶。 2.3 流加操作方式的溶菌醉复性 用微量蠕动泵以0.05ml/nun的流速将变性溶菌酶泵人38m]缓冲液 (pH8.0的0.1MTris- CI含1mMEDTA,0.15mMNaCl和一定浓度的脉)中进行复性，分数次泵人，间隔4h，总的流 加体积为2ml。试验装置如图1所示。 2.4 溶菌踌 自由一SH残基数的浏定 依据Ellman，法[6]测定变性态和复性工程中的溶菌酶自由一SH残基数。 2.5 溶菌酶活性及蛋白质浓度的浏定 溶菌酶活性用F.I.P法[[61测定，蛋白质浓度则采用CoomassieBrilliantBlue法[7]测定。 3 结果与讨论 3.1 变性液中DTT 的浓度对淳菌酶 自由一SH残基数的影响 525 40mg/mlDenatured lysozt- Zml 吐朋smUmin 30m1 Ren.官.ratoin b朋月1er IM.公.,ti--stirtrt FIg.ISchematicshowoffed一batchopera目。 Tabk.I hlluenceofDTT onthefreeSHofdenaturedlysozymeandactivityrecovery