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中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 核酸识别快速检测水泡性口炎病毒和定型的研究 花群义，张念祖“，周晓黎，董俊，杨云庆，徐自忠 (云南出入境检验检疫局，650228) (¨农业部热带亚热带动物病毒病重点实验室，昆明，650224) 水泡性口炎(Vesicular 引起的牛、猪、马、鹿等多种动物和人的一种病毒性人畜共患传染病。感染人后出现类似流感和登革热症 是短期发烧，口腔粘膜、乳头上皮、趾间及蹄冠上出现丘疹和水泡，大量流涎。临床症状与口蹄疫(FMD) 很相似，不易区分。许多国家均有本病发生，主要使猪和乳牛的生产能力下降而造成严重的经济损失。国 重要意义。 目前，本病的诊断一般采用病毒分离与鉴定，从感染组织中制备抗原进行补体结合试验(CF)和病 毒中和试验(VN)，但这些诊断方法所需时问较长，不能满足对该病作快速确诊的要求。国外有人建立了 感染动物后8天才可产生抗体，血清学方法更不能用于快速确诊。对于VsV的生态学研究还不很清楚， Monath 对带毒动物的监测和快速诊断，在疫病控制和肉食品安全检测中具有重要意义。为探索特异、敏感、安全 和快速的VSV检测方法，根据Ancheuo等报道的VsVL基因的核酸序列，进行了PCR技术研究。 1、材料与方法 1．1病毒株：VSV—NJ株和VSVIND株均引自美国国家兽医诊断实验室，由本室保存。 1细胞，按常规方法进行滴定。该研究套个试验过程 1．2病毒繁殖和谪定：VSV繁殖和滴定用BHK2 在生物安全三级实验室(P3实验室)内完成。 TATCTCACT3’， 外侧gI物I(P1)：5’ATGACTTAGAGAAGA A．AAGACGCTACTATCTAT 外侧弓I物Ⅱ(P2)：5’ATC ATG3’， TTCGGATACACC NT半套式引物(P3)：5’T从AGC CAAAAATGTC3’， CCCGTCTGCGACTCCC从AAATGTG3’。 IND半套式引物(P4)：5’GAG 半套式引物分别根据NJ株和IND株扩增区的碱基差别设计。由宝生物工程(大连)有限公司合成。 mini 取700ul加Rneasy 6C保存备用。 1．5反转录合成CDNA模板1．5ml 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 1．6 PCR 1．6．1外侧引物扩增条件选择：按照有关文献介绍的方法优化各步反应条件及最佳参加反应试剂的浓 度，筛选并确定PCR工作程序。 1细胞提取核酸，同样方法反转录、扩增，电泳观察扩增结果。 牛病毒性腹泻／粘膜病病毒，正常13HK2 10、1、0．1、0．01TCID50，分别取lml提取RNA反转录，PCR扩增。 1rain、7222 覆以液状油60ul。用94℃imin、5522 增产物琼脂糖凝胶电泳观察。同时傲两个型交叉扩增试验。 产物分析。用双脱氧链终止法测定序列。 1．7实验动物感染试验和牛、山羊胚胎病毒感染试验样品的检测：选择健康成年豚鼠10只，在有严格 防疫条件的实验动物室隔离饲养，足垫部皮内接种VsV，设立3只对照，取足部水泡皮液检测，为防止 VSV RNA降解，水泡皮液置冰盒送一7022保存。 养时期作一些净化处理(分7组)，检测后综合分析试验结果。山羊胚胎通过超数排卵、本交、冲洗输卵 管获得。按上述设计的方法进行病毒感染试验，取样品检测。 2、试验结果 2，1外侧引物扩增结果