中药材DNA分子标记研究技术问题词1.植物药基因组DNA提取(摘要).pdfVIP

2结果 共得到116条带。对扩增条带进行统计．每一位点有带记为“l”(强带和弱带同记)，无带记 为“0”。得到数据矩阵，用DICE相似性系数计算相似性，用UPGMA得到聚类图(图略)。 3结论和讨论 RAPD结果明显地把33个样本聚为3群．所划分的3个类群与叶形分化类型基本一致， 与表型性状相关性研究的结论基本吻台。其中典型厚朴的样本f3—5．1 3一】5。3卜33，叶端呈小凸 尖形)分支的分辨率最好，即该分支在遗传上与其他种源差别较大．分支内不同种源同有一定 的遗传分化，但种源内单株间表现比较一致；典型凹叶厚朴群(1．2．6，7+9，叶端凹陷成两裂片) 的支持率较差，但群内两个种源的样本遗传分化明显；过渡类型的样本(10．12，16-30，叶端由 徽尖至微凹)，包括四川灌县的样本(22—24)．种源间差异不明显，种源内单株间的遗传变异与 种源间的差异相当，形成一个复合的群体。将厚朴分为三个地理宗更为合理。其中；ll*k属于典 型的厚朴．温朴(以往文献中常归为凹叶厚朴)应属于过渡类型．典型的凹叶厚朴仅局限分布于 少教地区。 中药材DNA分子标记研究的技术问题 1．植物药基因组DNA的提取(摘要) 郭宝林李家实 阎玉凝 (北京中医药大学，IL*100029) 1材料的预处理 1．1洁净 根、茎、果类材料要用刀认真刮取干净部分。花、叶、种子等或小饮片等材料则在尽可能切 击菌斑、菌块之后，用次氰酸、乙醇浸洗，或用紫外灯照射，有些植物有与细菌或真菌共生现象， 菌丝深入到组织内部．则外来DNA不可能去除干净。 1．2粉碎 材料经液氮速冻后粉碎是通用方法。 2一般提取方法 2．1 CTAB法 CTAB(Cetyltriethylammonium bromide)是一种去污剂，它可与核酸形成复合物，这些复合物 mol／L NaCl)， 在高盐溶液(O．7 NaCI)中可溶并且稳定存在，但如果降低盐的浓度(O．3mol／L CTAB与核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来，而大部分的蛋白及多糖仍溶于溶液中。 抽提缓冲液中加入一定量的}巯基乙醇，可起到防止酚类载化的作用，如果材料中酚类成 分较多，可将其含量提高到6％。技术关键是提取过程中加入l0％CTAB提取液和l％CTAB ·118· DNA复合物沉淀不易产生或得到的DNA会有部分 沉淀缓冲液的量一定要准确，否则CTAB 降解。 当材料中多糖少时，可不用1％CTAB沉淀缓冲液来沉淀DNA，在经氯仿t异戊醇(24： 1)抽提之后，用异丙醇或乙醇沉淀DNA．使提取过程简化。 2．2 SDS法 c对 SDS(Sodiumdodecylsulfate)是阳离子去污剂。用含有高浓度SDS的抽提缓冲液在55 植物细胞进行裂解后，用提高盐浓度(KAe或NH·Ac)和降低温度(球上保温)的办法沉淀除去 蛋白和多糖．剩下的DNA再进一步纯化．该法提取出的DNA常含有较多的多糖·但如果材料 本身多糖含量不高或其含量未超过～定限匿而对进一+步研究无影响时仍可使用。 3 DNA提取过程中杂质的去除 3．1去除多秸 如果材料中舍有较多多糖，其提取液常比较粘稠，多糖常与DNA共沉淀而使沉淀物呈胶 冻状。少量的多糖一般不影响DNA的限制性酶解或扩增，但当下一步研究无法进行时，是要考 虑在提取DNA过程中去除多糖。 3．2去除酚类 含有酚类杂质的DNA其沉淀物多呈黄色至褐色，难以溶解或溶液色深。由于酚类化合物 在植物材料中存在十分普遍，因而抽提缓冲液中要加入一定量的辟琉基乙醇(防止酚氧化)， PVP(聚乙烯毗咯烷酮，可与酚类结合)也十分常用，但有时仍无法全部去除。 4花(孢)粉、种子或浸制标本的DNA提取 4．1花(孢)粉 紊、半纤维素酶消化．以及微珠机械粉碎等方法，试验了8种裸子植物和被子植物花粉·以最后