马-牛异种核移植的初步的研究.pdfVIP

中国畜牧兽氏学会动物繁殖学分会第t州肺学术研讨会论文集 马一牛异种核移植的初步研究 沈彦军-，衰天杰-，庞云渭-一，杜卫华-，朱化彬-· 1．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193；2．中国农业科学院草原研究所，呼和浩特010010 摘要研究目的及意义：异种核移植在物种的改良、濒危动物的保护；研究核质关系、基因表达调控、细胞分化和物种进化以及胚 胎干细胞等方面具有重要的研究意义。手工克隆(Handmade 且具有较高的融合率和囊胚率，为体细胞克隆技术的应用研究开辟了一条捷径。本研究运用手工克隆技术利用马的体细胞和牛 的卵母细胞构建重构胚胎，对马牛异种手工核移植进行了初步研究，为以后的研究打下基础。材料和方法：1．供体细胞培养剪 建及体外培养将体外成熟培养18h左右的cOcs去除颗粒细胞，挑选排出极体的去核，经去除透明带，作受体胞质。构建重构胚 垂直，然后将另一半卵粘附其上，排列顺序为半卵一体细胞一半卵，并使其排列方向与电极垂直．最后给以50v／栅，9s，1个脉冲 7l／1 重构胚发育情况．结果：马一牛重构胚经激活、体外培养后，融合率为93．9％(182)。培养48h后统计分裂率为91．2{l (156／1 3／156)、4一细胞以上为66．1％(103／1 71)，其中2—4一细胞为33．9％(5 56)。培养7d后发现无囊胚出现，发育至16一细胞以 上为19．8％(31／156)。利用马微卫星特异引物对分裂的各时期胚胎分别进行核遗传物质检测，发现其与供体马具有相同的基因 型，证明所构建的重构胚具有供体马的遗传物质。讨论：重构的马牛异种核移植胚胎，体外培养得到较高的融合率和分裂率，表明 牛的卵母细胞能够支持马体细胞的重编程和手工克隆技术具有简单、高效的优点。但是重构胚在16一细胞期出现发育停滞的现 象，未能发育到囊胚．发生阻滞的时期正是新mRNA、rRNA和蛋白质合成启动的阶段。前几个分裂时期的合成代谢主要是由卵母细 胞质中的原有mRNA、rRNA指导完成。随着胚胎的发育，供体细胞核基因组开始启动转录，重构胚的分裂逐步由受体胞质的mRNA． 对培养条件特别敏感，稍有不适便会出现不可逆的发育停滞。在下一步的实验中计划通过改进培养条件和方法，促使重构胚发育 必需基因表达，克服发育受阻现象．并对重构胚胎的线粒体命运和核基因组DNA甲基化进行检测，以研究异种核移植胚胎的核质 互作和核重编程问题。 关奠词异种核移植，手工克隆，马，牛，重构胚 (上接第245页)野生型基冈互补，而与突变型基因不互补(反之与突变型基因互补，而与野生型摹因不互补)，同时3， 端错配碱基的引入更强化了引物的错配效应。这样PCR引物扩增时就会特异性的只扩增野生型基因(或突变型基 因)，经电泳后可以直接进行SNP的分析鉴定。 venebml (Complex 行了引物设计，将上游引物的3’末端设置在CVM突变位点，同时在靠近引物37端的第五、六位碱基位置引入了 两个错配碱基，这两个碱基的错配增加了对CVM致病基因的特异性效果，而野生型个体却因为两个连续的碱基错 配加剧了引物37末端的错配效果而小能产生扩增产物，为了避免出现假阴性结果，在PCR反应中又加入了内标引 物。检测结果与CRS．PCR法的检测结果完全一致，测序结果更进一步证明了特异性PCR扩增法的科学可靠。特异性 PCR扩增法也是检测已知突变位点SNP的有效方法，不需要限制性内切酶，操作简便、结果准确、费用低，但是PCR 反应体系条件优化是应该注意的问题(Y蚰etal，2002：魏秀阿等，2005；韩立中等，2007：王帅等，2008)。 总结上述检测方法，在不借助于其它昂贵的检测仪器的前提下，这几种方法都可成功地进行SNP的检测分析，但在 行多态性的检测分析，但同其它方法相比，特异性PCR扩增方法具有需时短、操作简便、成本低等优点，在将来的遗 传多态性榆测分析中具有较广阔的应用前景。 肌肉生长抑制素基因是骨骼肌生长发育的负调节因子并因为其对动物肌肉生长发育的重要作用己引起研究者 的广泛关注。目前对该基冈的结构、遗传机制及定位和功能较清晰的认识，为利用该基因进行标记辅助选择培育肉 用家畜提供了前提基础，而该基因已被广泛应用于指导很多物种、品种的育种工作，如意大利皮埃蒙特牛的选育，比 利时兰牛的选育等，关于该基因多态性检测分析也发明了较多