体外成骨细胞分离培养技术在中医药研究中应用.pdfVIP

302 中医药发展与人类健康 不是统一战线政策所期望的。幸而我们及时采取措施，挽回殆势，这样才保障了卫生部公布大臣新决 定时，没有人公开出来反对。 以上是根据英国争取中医独立(相对)立法5年来的过程和个人经验体会，提出一些看法。不当 之处，尚祈教正。 体外成骨细胞分离培养技术在中医药研究中的应用 杨靖董福慧常德有 中国中医研究院骨伤科研究所，北京(100700) 成骨细胞是骨形成细胞，是骨形成和代谢的核心部分，对骨组织的生长发育和骨损伤的修复起关 键作用。体外培养成骨细胞是研究骨代谢和成骨机制的重要手段。许多实验证实，体外培养的成骨细 胞具有与体内成骨细胞相同的生物特性，能很好地反映成骨细胞的功能活动特点，为采用体外成骨细 胞培养技术进一步深入研究骨发生、生长机制，及中药对其干预作用提供了理论基础。近年来，越来 越多的学者利用体外成骨细胞分离培养技术开展中医药促进骨折愈合及骨质疏松证治疗机理的实验研 究，取得了可喜的成果。现就这方面的研究情况综述如下： 一、体外成骨细胞的分离培养 (一)成骨细胞的获得 目前，可用于实验研究的成骨细胞模型有四类：一是原代分离培养的成骨样细胞群，该细胞群离 体时间短，生物学特性及成骨能力与体内相比具有很好的相似性；二是从正常组织中克隆传代的成骨 样细胞株，它具有成骨细胞固有的生物学特性，细胞成分单一，与体内成骨存在一定差异；三是从肿 瘤细胞中克隆传代筛选建立的成骨样细胞株，该细胞株增殖速度快，具有致瘤性，与体内成骨有较大 差异；四是利用转基因技术建立的永生细胞株，该细胞多为非二倍体细胞，与体内成骨细胞生物学特 性和成骨能力差异很大。因此，原代分离培养的成骨样细胞是目前研究中主要的细胞来源。而从大鼠 的乳鼠颅顶骨分离成骨细胞是目前最常采用的成骨细胞取材方法。采用大鼠乳颅骨分离培养的成骨细 胞生长性状稳定，增殖速度快，具有与体内成骨细胞相同的生物学特性。龚泰芳等用SD乳鼠颅顶骨 分离培养成骨细胞，2h即开始贴壁，2天即可见较多细胞生长，7天可见细胞团灶。利用小鼠乳鼠培 养成骨细胞，因取材容易，成本低，且生物特性与体内相似，因此亦广泛应用。王玉东等采用8～9 月龄队LB／C小鼠去卵巢取头盖骨分离培养成骨细胞，获得了满意结果。除此之外，兔的骨膜、骨髓 分离培养成骨细胞，亦有报导。闫爱民等用产前1周的孕兔颅骨采用组织块法分离培养成骨细胞，在 3天后即可见成骨细胞生长，至第11天取得了大量的成骨细胞。朱伟南等用2周龄新西兰兔双后肢胫 骨前内侧面骨外膜进行成骨细胞分离培养，结果4天后即可见大量成骨细胞生长。吴凯等取新生新西 兰大白兔胫骨骨髓，分离后加入条件培养液进行体外培养。结果证实骨髓基质细胞经诱导可转化为成 骨细胞。人成骨细胞的体外培养过去由于涉及到伦理、道德约束以及取材的限制，此项研究开展并不 广泛，但近年来随着科学研究的发展及骨科手术学的广泛开展，利用人骨培养成骨细胞的研究逐渐增 多。李娟等用酶消化法从成入髂骨松质骨分离人成骨细胞，72小时后可见成骨细胞逐渐贴壁生长，1 周后呈现成骨细胞形态。许勇等取14周人胚胎胫骨近端进行分离培养，4天后可见短棱形细胞出现， 1周后明显增多，第10天细胞长满培养瓶，传代后细胞生长加快。于有等取儿童髂骨进行细胞分离培 中医发展论坛 303 养，结果四次取材培养均获得成骨细胞，且传代培养后稳定增殖。近年亦有报道用山羊的颅骨i下颌 骨分离培养成骨细胞，其结果证实所培养的细胞具有典型的成骨细胞特性。 (二)成骨细胞体外分离及培养方法 成骨细胞体外分离培养最常采用的方法为酶消化法。其方法是无菌条件下取自动物的骨块用PBS 液洗涤后移人胰蛋白酶、胶原酶消化液中消化1520min后，弃消化液，再用酶消化液消化，收取消 化液离心后收集细胞，接种于含1096胎牛血清培养液的培养瓶中。刘莉等采用多次胶原酶消化法进行 成骨细胞体外培养，即将取自新生大鼠颅骨骨片加入0．1％II型胶原酶，静置10min后去消化液，然 牛血清的无菌离心管中，再将骨片用同样的方法重复消化两次后，将含有细胞的消化液离心，弃上清 液，加入含胎牛血清的培养液中，吹打混匀，收集细胞悬液，接种于培养瓶中，结果成骨细胞体外培 养模型建立成功。林清泉等采用胶原阶梯消化法进行鼠颅骨体外培养，即依次用1．0％、0