强阳离子交换毛细管液相色谱-反相加压毛细管电色谱二维体系在分析牛血清白蛋白酶解物分离中应用.pdfVIP

全国生物医药色谱学术交流会(2010)论文集 B27强阳离子交换毛细管液相色谱．反相加压毛细管电色谱 二维体系在分析牛血清白蛋白酶解物分离中的应用 吴漪王彦谷雪阎超事 上海交通大学，上海，200240 关键词：二维色谱，强阳离子交换色谱，加压毛细管电色谱，牛血清白蛋白(BSA)酶解液 前言 J正 目前以蛋白质组学、代谢组学和生物信息学为代表的系统生物学(systemsbiology)【l 成为国际瞩目的研究热点，这需要高效、高分辨率和高峰容量的分析技术作为支撑，然而传 统的一维色谱分离模式不足以对复杂样品体系进行完全分离。1984年Giddings【2】提出多维联用 系统总峰容量等于每维峰容量的乘积，近年来在复杂体系的研究中获得了快速的发展和应用。 加压毛细管电色谱(Pressurized Capillary 力流来推动流动相，融合了HPLC高选择性和CE高柱效的双重优势，且不易产生气泡，定量 精度高，可实现梯度洗脱，非常适合用于复杂体系的分析。但目前的研究仅限于pCEC一维体 系的开发和应用，pCEC与其他分离体系的联用仅有应用于黄柏的二维联用体系【4】。在本研究 中，构建和发展了强阳离子交换毛细管液相色谱与反相加压毛细管电色谱的二维联用技术， 并用于BSA酶解产物的分离研究中。 1．实验部分 1．1样品溶液的制备 取BSA粉末溶于100mmol／L的NI-14HC03溶液中配成25 mg／m1的BSA溶液并煮沸数分 钟，加入10mg／ml的胰蛋白酶使溶液中BSA与胰蛋白酶的比例为451。然后将此混合液放 入37C水浴中酶解12小时。酶解液用O。22岬膜过滤，置于4℃下避光保存。 1．2二维色谱条件与操作 X 10锄．， 第一维是强阳离子交换毛细管液相色谱模式(p．SCXLC)，色谱柱：300岬i．d 2．5 0．5mol／LNil4Cl溶液一乙腈．TFA(95：5：0．1，v加)，洗脱梯度：O～5min，O％B；5～40min，0 ～50％B；40～50 min，50～100％B。柱流速：4皿／min。进样量：5止。 55 B：20 mmol／LNH4CI溶液．乙腈(5：95)，洗脱梯度：0～5rain，0一lO％B；5～35min，10～50％ B；35～45min，50～100％B。检测波长：230nm。柱流速：400nL／min。进样量：20儿。 样品经第一维SCX柱的分离，在死体积之内的洗脱液弃去，此后的洗脱液每5分钟收集 一次，共收集9个馏分。再将此洗脱液输送进第二维反相加压毛细管电色谱柱中，用第二维 流动相中的A液对样品冲冼10 min，进行脱盐处理，然后开始第二维pCEC的梯度洗脱，用 ·通讯联系人：阎超，博士，教授，博士生导师。Tel：(021E—mail：chaoyana@unimicrotech．eom 基金项目：国家科技部农业科技成果转化资金项目(2008002)，上海市科委科学仪器环境条件建设项目 (09142200202)和国家自然科学基金项目 58 全国生物医药色谱学术交流会(2010)论文复 uv进行样品检测。 2．结果与讨论 2．1=堆系统的构建 本研究第一维选择强阳离子交换毛细管液相色谱．SCX柱是根据样品中组分带电性质的 不同来进行分离，比较适合用f分析蛋白质多肚类物质。第二维选择反相加压毛细管电色谱． 是根据物质的疏水性质来进行分离．BSA酶解渣在C18柱上也可以被较好地分离。在实验操 作中采用离线接口模式，第一维SCX柱流动相使用线性盐梯度，柱后连接收集系统收集第一 维的洗脱液，冉将每个馏分全部进样到C18柱并分离分析。 2,2