抗肝纤维化中药复方血清药理学研究方法和应用.pdfVIP

抗肝纤维化中药复方血清药理学研究方法与应用 刘成海’刘平刘成徐列明 内容摘要分离培养大鼠肝细胞及星状细胞．扶正化瘀方灌胃正常大鼠制备血清， 以不同整体动物口服剂量、荮物体内作用时间(取血时间)以及体外不同药物血清浓度 温育大鼠肝细胞及星状细胞；或者扶正化瘀方冻干为粉末直接添加于培养细胞．通过观 察细胞增殖与细胞活力等功能变化，研究不同条件的药物血清对细胞功能的影响，以建 立抗肝纤维化的体外给药方法一血清药理学(含药血清药理方法)方法，并将该方药物 血清与拆方药物血清作用于培养细胞，观察其对细胞胶原生成与转化生长因子表达的影 响等，研究扶正化瘀方的细胞与分子药理机制与组方原理．结果表明选用与细胞来源同 种的动物，间隔2h二次给药再1h后取血，并56C、30m]n灭活的含药血清能较好地用 于抗肝纤维化的体外药理试验．该方药物血清明显抑制不同原因激活的星状细胞增殖， 抑制其胶原基因表达与蛋白生成，抑制TGF．B1的基因表达与分泌，阻止细胞的自分泌 活化．促进损伤肝细胞功能的功能修复，抑制其异常细胞增殖与胶原生成。提示药物血 清这些作用是扶正化瘀方抗肝纤维化的主要细胞分子药理机制。扶正药抑制胶原生成作 用较强，化瘀药抑制细胞增殖与活化作用较强，而全方综合效果较好，说明扶正化瘀方 作为一个组方整体，具有多位点、多环节的作用特点． V 关键词：血清药理学拎药血清肝纤雏化肝星状细胞肝细胞细胞增殖胶原 基因表达组方 复方的体外药理实验方法一复方血清药理学是当前复方药理研究的热点。。体外实验 简便迅速、容易控制，且可以人体细胞等进行，弥补动物实验与临床之间的差距。网此 进行复方的体外药理研究，对于判断药物毒性、提供临床参考剂量；观察药物效果、快 速筛选药物；从细胞分子水平阐明作用机理，从而提高fI右i床治疗及中药约理研究水平等 有积极意义。 +刘成海(上海中医药大学肝病研究所，邮编：200032) 76 第六次全国中西医结合实验医学学术研t寸台 中药复方成分复杂，炮制、吸收后会引起新的变化。如果沿J【{j西药或单体化合物药 理研究的方法，将复方粗提物(水煮或醇提等)直接添加于离体反应系中(培养细胞或 活性酶中)则可能引起三个问题：(1)缺乏经机体吸收代谢后的有效成分，造成假阴性。 (2)多出不经机体吸收的无效成分，造成假阳性。(3)粗提取物自々质、有毒物质、醇体 过程中醇本身等对离体体系的影响，如pH值、渗透压、醇对蛋白质的沉淀等等。而临床 上中药大多经口服吸收入血，代谢后经血液达到病变部位，发挥作用。因此用含药的“药 物血清”理论上可避免直接添加的一些弊端，反应药物的体内实际作用。80年代后期， 人们开始尝试将整体动物灌胃给药后分离其药物血清，而后仵Hj于体外细胞或酶的含鳓 血清药理法，也称“血清药理学方法”。但是，该方法起步较晚，涉及约理约代等领域较 多，存在问题也较多，尚缺乏系统性与规范性。是复方药理研究的热点之一…。 肝纤维化是慢性肝病的重要病理过程，肝细胞损移j、星状细胞活化在肝纤维化病例 过程中起着重要作用，抗肝纤维化在防治慢性肝病中有着重要意义。扶止化瘀方，也称 肝平胶囊，由虫草菌丝、丹参、桃仁等组成，既往动物试验和临床观察发现该方能够抑 制肝脏结缔组织增生、促进其降解，有着良好的抗肝纤维化作_}}3”1。95年起，在国家自 然科学基金与国家中医约管理局基金等的资助一卜，为深入研究扶止化瘀方的细胞药理机 制，我们根据狄原幸夫提出的血清药理学思想，以培养的肝星状细胞、肝细胞等为细胞 模型，以不同121服剂量的扶正化瘀方整体动物灌胃给药，不同时相采集其血清，而后不 同体外血清温育浓度添加于离体培养系中，探索建立复方抗肝纤维化的血清药理学实验 方法，探讨扶正化瘀方的抗肝纤维化的细胞与分子作用机理，及其组方原理。 1方法的建立 1．1细胞的分离培养 与肝纤维化密切相关的肝脏细胞主要有肝细胞、星状细胞及成纤维细胞。因此我们 分离培养了正常或DMN纤维肝模型大鼠肝细胞、星状细胞。 按改良Fridman法分离及培养星状细胞。即大鼠经蛋白酶、胶原酶消化滞流， 脏，细胞活力98％以上，细胞鉴定依据相差显微镜下富食脂滴的典!姓形态及结蛋白兔嫂组 化染色阳性，细胞纯度90％以上。细胞长满单层后传一代培养。，以改进中村氏方法…分 离培养肝细胞， ——————————————————————————————