添加不同发情时期山羊血清对牛胚胎体外发育的影响.pdfVIP

维普资讯 第 29卷第 1期 黄 牛 杂 志 Vo1．29 No．1 2003年 1月 ]ournalofYellow CattleScienee _Tan． 2003 文章编号：1001—9111(2003)01—0016—03 添加不同发情时期山羊血清对牛胚胎体外发育的影响 张志平，安志兴，李向臣，王 超，张 涌 (西北农林科技大学 生物工程研究所 ，陕西 杨陵 712100) 摘 要 ：为了提高牛体外胚胎囊胚发育率，添加不同发情时期山羊血清对牛胚胎进行体外培养。分别 采集发情周期DO、D2、D4和D7山羊血清(发情当天为DO)，灭活除茵备用。结果表明不同发情时期 羊血清对孤雌激活胚胎卵裂率影响差异不显著，囊胚发育率分别为 29．5 、32．4 、33．9 和 41．3 ，D7血清能显著提高囊胚发育率(P0．05)，且扩张和孵化胚 出现较早。添加DO血清体外受 精胚胎卵裂率较高，但对囊胚发育率影响差异不显著。说明孤雌激活和体外受精胚胎发育有差异， D7血清对胚胎后期发育有利。受精胚无血清培养3d后添加D7血清，囊胚发育率为42．9 ，是较为 理想的培养方法。 关键词：胚胎 ；孤雌激活；体外受精；胚胎培养；血清；牛 中图分类号 ：$823．3 6 文献标识码：A 随着试管动物和体细胞克隆动物相继成功，标 1．2 不同发情时期山羊血清的制备 志着胚胎工程技术迈进了一个崭新的时代。但 目前 从胚胎移植受体羊群中选体况 良好、发情周期 胚胎体外发育率低仍然是胚胎工程的一大障碍。牛 正常且记录准确的山羊进行采血 。为减小羊血清个 体细胞克隆胚胎体外培养囊胚发育率很低，移植后， 体差异对实验结果 的影响，分别选发情 D0、D 、D 得到后代仅为0 ～5 [13。如果胚胎在体外培养到 和D 各四只颈部采血 (发情 当天为Do)，每只羊采 囊胚后移植 ，能极大地减小多胎妊娠风险，而且也提 10mL，发情 时期相 同的混匀，在 4℃下静置 4h， 高了移植效率[23。同时只需将胚胎移植到子宫角，操 3500rpm 离 心 10min，然后 56℃灭活 30min， 作方便。因此建立有效的体外培养系统具有重要意 0．22 m滤膜过滤，小剂量分装、冻存备用。 义。胚胎培养中血清很重要，可提供生长因子、矿物 1．3 卵母细胞孤雌激活和体外受精 质、激素、维生素及蛋 白质等物质[33。本实验使用不 1．3．1 卵母细胞孤雌激活 卵母细胞成熟 24h 同发情时期山羊血清研究其对胚胎发育的影响，以 后，去除颗粒细胞 ，选取有第一极体排出且胞质均匀 期提高囊胚的发育率。此方面还未见报道。 的成熟卵母细胞，在含 5 M Ionomycin的 mSOF 1 材料和方法 中激 活 5min，然后 再 在含 2mM 6一DMAP 的 mSOF激活 4h，用培养液清洗 3次，放人预先制备 1．1 卵母细胞的采集和成熟 的颗粒细胞单层共培养体系进行培养。 牛卵巢采集于西安市屠宰场 ，在 25~30℃无菌 1．3．2 卵母细胞体外受精 牛冻精在 37℃水浴解 生理盐水中4h内运 回实验室。抽吸法收集直径为 2 冻，将精液缓缓注入盛有4mL预平衡 2h 以上B0 ～ 8mm 卵泡卵泡液，在体视显微镜下选择具有三 液的试管底部，上浮获能 1h。然后将获能精子加入 层 以上完整卵丘细胞及细胞质均匀的卵母细胞，放 50 L含有 B0液的受精微滴 ，最终浓度为 1×10 人预平衡 2h以上的成熟液 中进行成熟培养 24h。 mL，受精 24h后移人培养液