体细胞核移植生产Mx1转基因猪.pdfVIP

2010广州一东莞首届国际小型猪学术论坛 体细胞核移植生产Mxl转基因猪★ 杨化强1，杨东山19范沛2，赵本田1，欧阳振1，顾为望h，赖良学1★ (中国科学院广州生物医药与健康研究院，广州510663 南方医科大学比较医学研究所，广州510515) 抗病毒能力，对许多RNA病毒，甚至对DNA病毒都有一定的作用，但也存在一些没有抗病毒活性的Mx 猪细胞经IFN．u或双股RNA诱导后可产生大小分别为76kD的Mxl蛋白和73kD的Mx2蛋白，其中 Mxl蛋白有抗流感病毒和VSV的活性，而Mx2蛋白则无此活性13J。 世界已有多家实验室制备了Mxl转基因小别4，5J，并且证实该转基因小鼠对1918年流行的大流 感具有抗病性。因此，本实验拟培育能持续表达Mxl基因的转基因猪，使Mxl转基凶猪与小鼠一 样，产牛对多种病毒产生抗性，降低其感染率，对于养猪业和经济发展无疑是具有重要作用的。并 且对目前最为关注的流感来讲，猪也是处于核心地位的。猪被认为是一个病毒交叉感染媒介，因为 猪既能感染禽流感病毒又能感染人流感病毒。研究认为禽流感病毒和人流感病毒正是在猪体内产生 重组，才得以产生具有感染人能力的禽流感病毒。本研究制备的转基因猪若具有抗流感病毒的能力， 将对人类健康也具有重要意义。 1．材料与方法 1．1猪Mxl基因的克隆与表达载体的构建 Mx 扩增引物为：Mx1．F：TAATCTAGAATGGTTTATTCCAGCTGTGAAAGTAAAG：1．R： pMXI-2A-EGFP。 1．2猪转基因成纤维细胞的筛选 并晾干备用。复苏西藏小型猪PFF细胞，使其在48h内长至70．90％汇合度，细胞收集后虫悬浮于 600ulPBS，并加入适量线性化质粒，用电穿孔法(BioRad，GenePulserXcell)进行基因转染，电转 G418(Merck)进行筛选， 条件：电压230V，电容500uF。电转后细胞培养48h，添加1000ug／ml 直至形成单克隆，挑出带绿光单克隆扩大培养并鉴定，冻存。 1．3体细胞核移植制备转基因猪 挑选成熟培养的猪卵母细胞采用融合法进行体细胞核移植，过程简述如下：用盲吸法去除MII 卵母细胞，选取一个转基凶体细胞注射到透明带下，并使之与卵母细胞质膜紧密接触，直流电击(1．2 kV／cm，301as，2次脉冲)诱导体细胞与去核卵母细胞融合形成重构胚并使之被激活。所用工具、液体、 仪器从略。重构胚体外发育24h后进行胚胎移植，自然发情第O天或第l天的育成母猪用作受体， authers ‘·共同通讯作者co-corresponding 395 型!：：尘i些j!型塑：：!i 受体品种为西藏小型猪，进行输卵管深部移植．每头猪移植至少120到180枚胚胎。胚胎移植后， 对未返情的受体于28～30d进行首次超声波妊娠检测，之后适时进行检测以跟踪胎儿发育情况，调 整饲养管理，直至转基周克隆猪出生。 I 4转基因猪的鉴定 H{后牛的个体以体外黄光蛋白观测仪(MLS 基因组DNA(Iiangen)，进行PCR鉴定，鉴定引物为Mxl-I GAPDH．口1：CAGCAATGCCTCCTGTACCA． 1WTCATGGA． GAPDH-q2：GATGCCGAAG Mxlql：cacagtactgccaagtccaa,Mxlq2gc89bcacgnclgdcca 2结果 2 1 h1表达载体的构建与转基因成纤维细胞的筛选 以IFN 融合表达，构建转摹因表达载体，2A足来自口蹄疫病毒的一段蛋白序列，能介导自身的有效切割， 使得前后融台表达的蛋r1分开，从而可以介导MxI和EGFP的融合表选，而目不会影响蛋白的活性 (图1)。 囤lMXl转基因表达质粒示意图 2 2转基因细胞核移植制备克隆猪 线性化质粒转染P